發(fā)布時間：2017-10-07 00:06

  本文關(guān)鍵詞：藍(lán)氏賈第鞭毛蟲三種基因功能研究載體的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲 標(biāo)記載體 表達(dá)載體 蛋白標(biāo)簽

【摘要】：藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia，簡稱賈第蟲)是一種單細(xì)胞寄生性原蟲，可引起藍(lán)氏賈第鞭毛蟲病。賈第蟲是生物進(jìn)化過程中最早分化出來的真核生物之一，在生物進(jìn)化中有著特殊的地位。隨著賈第蟲基因組測序的完成，賈第蟲研究逐漸步入基因功能階段。外源基因及重組基因的體內(nèi)表達(dá)是研究基因功能的重要手段。目前分子生物學(xué)研究中常見的表達(dá)載體基本不能用于賈第蟲基因功能研究�；谝陨蟽蓚�方面的要求，本研究擬構(gòu)建一個帶有HA標(biāo)簽的賈第蟲基因快速標(biāo)記載體和一個賈第蟲穩(wěn)定表達(dá)載體，并進(jìn)一步構(gòu)建帶有SNAP/CLIP融合蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體。 本研究采用重疊PCR的方法將Neo基因置于gdh啟動子調(diào)控下構(gòu)建抗性基因表達(dá)框，并插入pGEM-5zf(+)載體，獲得帶有Neo篩選標(biāo)記的重組載體pGLgdh-Neo；將基因合成所得3'末端帶有3個HA標(biāo)簽的MCS區(qū)克隆至上述載體，構(gòu)建了帶有MCS區(qū)及3個HA標(biāo)簽的可快速標(biāo)記藍(lán)氏賈第鞭毛蟲基因的重組載體pGLMCS-3HA-gdh-Neo，長度為4268bp。以賈第蟲組蛋白H2A為標(biāo)記基因驗(yàn)證所構(gòu)建載體的有效性。對H2A賈第蟲重組株進(jìn)行基因組PCR、蛋白質(zhì)印跡及免疫熒光分析。H2A重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至賈第蟲滋養(yǎng)體并正確整合至其基因組，可表達(dá)HA標(biāo)記的H2A。 以pGLgdh-Neo為基礎(chǔ)，在gdh5'UTR端插入賈第蟲tim基因以方便載體與基因組整合，得到pGLtim-gdh-Neo；設(shè)計(jì)并合成α2-Tubulin啟動子驅(qū)動的含有16個酶切位點(diǎn)的MCS區(qū)的完整表達(dá)框，ApaⅠ單酶切插入pGLtim-gdh-Neo，構(gòu)建了可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，，帶有多克隆位點(diǎn)區(qū)及Neo抗性基因的重組表達(dá)載體pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo，其長度為5395bp。在MCS區(qū)插入Luc，對Luc重組株進(jìn)行熒光素酶活性檢測以驗(yàn)證重組載體有效性。Luc重組質(zhì)粒pGLtim-Tub-Luc-gdh-Neo穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至賈第蟲，且Luc重組株熒光素酶在蟲體中獲得表達(dá)。 分別將SNAP/CLIP序列克隆至重組載體pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo的MCS區(qū)，構(gòu)建分別含有SNAP/CLIP融合蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體。 本研究成功構(gòu)建了賈第蟲快速標(biāo)記載體pGLMCS-3HA-gdh-Neo，穩(wěn)定表達(dá)載體pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo及帶有SNAP/CLIP融合蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體，可用于賈第蟲基因的原位標(biāo)記、蛋白的亞細(xì)胞定位、基因過表達(dá)或敲除、蛋白相互作用及活細(xì)胞中融合蛋白標(biāo)記等方面的研究，為賈第蟲基因功能的研究提供有力平臺。
【關(guān)鍵詞】：藍(lán)氏賈第鞭毛蟲 標(biāo)記載體 表達(dá)載體 蛋白標(biāo)簽
【學(xué)位授予單位】：大連大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R382.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 1 實(shí)驗(yàn)一藍(lán)氏賈第鞭毛蟲基因快速標(biāo)記載體的構(gòu)建14-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑14-16
• 1.1.1 蟲株與質(zhì)粒14-15
• 1.1.2 試劑15
• 1.1.3 培養(yǎng)基15-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法16-26
• 1.3.1 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲基因組 DNA 的提取16-17
• 1.3.2 pGL gdh-Neo重組質(zhì)粒構(gòu)建17-22
• 1.3.3 賈第蟲快速標(biāo)記載體pGL MCS - 3HA -gah- Neo 的構(gòu)建22-23
• 1.3.4 應(yīng)用重組載體pGL MCS - 3HA -gdh- Neo 標(biāo)記賈第蟲 H2A 基因23-24
• 1.3.5 H 2A 重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染及 G418 篩選24-25
• 1.3.6 H2A 賈第蟲重組株基因組 PCR 鑒定25
• 1.3.7 H2A 賈第蟲重組株蛋白質(zhì)印跡分析25
• 1.3.8 H2A 賈第蟲重組株免疫熒光分析25-26
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析26-32
• 1.4.1 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲基因組總 DNA 的提取26-27
• 1.4.2 gdh 基因側(cè)翼序列和 Neo 基因編碼序列的 PC R 擴(kuò)增27-28
• 1.4.3 片段 gdh 5' UT R- N eo -gdh 3 ' U T R 的擴(kuò)增28
• 1.4.4 pGL gdh- Neo 重組質(zhì)粒 PCR 鑒定28-29
• 1.4.5 GlH2A 基因的擴(kuò)增29
• 1.4.6 GlH2A 的標(biāo)記載體pGL H2A -3HA- gdh -Neo 構(gòu)建29-30
• 1.4.7 H2A 賈第蟲重組株基因組 PC R 分析30
• 1.4.8 H2A 賈第蟲重組株蛋白質(zhì)印跡分析30-31
• 1.4.9 H2A 賈第蟲重組株免疫熒光分析31-32
• 1.5 實(shí)驗(yàn)討論32-33
• 2 實(shí)驗(yàn)二藍(lán)氏賈第鞭毛蟲穩(wěn)定表達(dá)載體的構(gòu)建33-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和質(zhì)粒33-34
• 2.1.1 質(zhì)粒33-34
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑34
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法34-39
• 2.3.1 pGL tim-gdh-Neo 重組質(zhì)粒構(gòu)建34-36
• 2.3.2 pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo 重組質(zhì)粒構(gòu)建36-37
• 2.3.3 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重組質(zhì)粒構(gòu)建37-38
• 2.3.4 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染及 G418 篩選38-39
• 2.3.5 熒光素酶活性檢測39
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析39-42
• 2.4.1 tim 基因的 PCR 擴(kuò)增39-40
• 2.4.2 pGL tim-gdh-Neo 重組質(zhì)粒構(gòu)建40
• 2.4.3 pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo 重組質(zhì)粒構(gòu)建40-41
• 2.4.4 Luc 的 PCR 擴(kuò)增41
• 2.4.5 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重組質(zhì)粒構(gòu)建41-42
• 2.4.6 熒光素酶活性檢測42
• 2.5 實(shí)驗(yàn)討論42-44
• 3 實(shí)驗(yàn)三 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲帶有 SN A P/ CLIP 融合蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體構(gòu)建44-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和質(zhì)粒44-45
• 3.1.1 質(zhì)粒44-45
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 3.3.1 SNAP/CLIP 的 PC R 擴(kuò)增45-46
• 3.3.2 SNAP/CLIP 標(biāo)簽重組質(zhì)粒構(gòu)建46-47
• 3.3.3 菌種凍存47
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析47-49
• 3.4.1 SNAP/CLIP 的 PCR 擴(kuò)增47
• 3.4.2 PCR法鑒定pGL tim-Tub- SNAP/CLIP- gdh- Neo 重組質(zhì)粒47-48
• 3.4.3 雙酶切法鑒定pGLtim -Tub- SNAP/ CLIP- gdh - Neo 重組質(zhì)粒48-49
• 3.5 實(shí)驗(yàn)討論49-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-52
• 論文綜述52-59
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 附錄A 縮寫詞59-60
• 附錄B 主要溶液的配制60-65
• 附錄C 相關(guān)載體說明65-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況80-81
• 致謝81

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳麗鳳;李建華;劉全;趙月平;曹利利;張西臣;;犬賈第蟲病毒轉(zhuǎn)染載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白在犬賈第蟲體內(nèi)的表達(dá)[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2007年01期

2 巨紅妹;王乙惠;張霞;王云華;李雅杰;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲基因快速標(biāo)記載體的構(gòu)建[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2012年03期

本文編號：985766