背景和目的: 1型糖尿病被認(rèn)為是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的選擇性破壞胰島β細(xì)胞的一種自身免疫性疾病。T1DM患者一旦出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,約有80%的胰島已經(jīng)被破壞,因此強調(diào)T1DM的早期診斷和早期預(yù)防的意義顯得尤為重要。一系列的自身抗原包括胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島素瘤相關(guān)蛋白2(IA-2)、鋅轉(zhuǎn)運體8(ZnT8)等被認(rèn)為是啟動自身免疫反應(yīng)的靶抗原。同時,一些細(xì)胞因子、趨化因子及炎癥介質(zhì)也參與了該自身免疫過程。其中,可產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子的Th1型細(xì)胞是致病性T細(xì)胞,而Th2型T細(xì)胞通過釋放IL-4和IL-10介導(dǎo)糖尿病的免疫保護作用。在應(yīng)用NOD鼠的研究中證實,胰島素/前胰島素尤其是胰島素B9~23肽段是啟動NOD鼠自身免疫性糖尿病的最主要的自身抗原[1]。借助于NOD鼠模型,應(yīng)用胰島素或胰島素多肽進行了大量的抗原特異性免疫治療的研究,如鼻內(nèi)或皮下給予胰島素B9-23多肽或改變的胰島素B9-23多肽可以延緩自身免疫性糖尿病的發(fā)展[2-3].但這個過程一般都需要借助于免疫佐劑的作用來刺激并增強抗原的免疫原性,單獨應(yīng)用抗原本身可能不足以被抗原遞呈細(xì)胞所遞呈,誘導(dǎo)免疫耐受。本研究著眼于抗原與抗原遞呈細(xì)胞之間的相互作用,應(yīng)用胰島素B9-23多肽體外負(fù)載DCs,探討其在誘導(dǎo)自身免疫耐受中的作用及相關(guān)機制。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells , DCs)是體內(nèi)最重要的專職性抗原遞呈細(xì)胞,在自身免疫性糖尿病的發(fā)病過程中具有重要的作用,同時,DCs在維持機體的中樞免疫耐受和外周免疫耐受中也發(fā)揮著極其重要的作用[4],因而對自身免疫性疾病的治療也具有重要的意義。在穩(wěn)定狀態(tài)下,DCs表達低水平的共刺激分子,具有較強的攝取抗原的能力,但刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力較弱,從而誘導(dǎo)機體的免疫耐受。DCs提供T淋巴細(xì)胞活化所必需的3個信號[5]。第一信號為DCs提呈的抗原肽-MHC分子復(fù)合物與T細(xì)胞受體(TCR)的結(jié)合;第二信號為DCs表面的協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合;第三信號為DCs分泌的細(xì)胞因子促使活化的抗原特異性T淋巴細(xì)胞分化為不同的效應(yīng)性T細(xì)胞亞群。只有當(dāng)這些信號同時具備時,初始T淋巴細(xì)胞才能被有效地激活成為效應(yīng)性T細(xì)胞,發(fā)揮免疫效應(yīng)功能,如果缺乏有效的第二信號,抗原特異性T淋巴細(xì)胞將發(fā)生調(diào)亡或被誘導(dǎo)成無能狀態(tài),形成免疫耐受。DCs表面表達的CD40、CD80、CD86是與T淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)受體CD40L以及CD28分子結(jié)合的最主要的協(xié)同刺激分子,本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)有效沉默共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達,使其處于發(fā)育的不成熟階段,然后體外負(fù)載胰島素B9-23多肽,制備出致耐受性DCs疫苗,觀察其對同種異體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的作用,進而探討其在自身免疫性糖尿病的預(yù)防和治療中的作用,為自身免疫性糖尿病的防治提供重要的實驗依據(jù)。 方法: ①siRNA合成 設(shè)計并合成針對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的特異性siRNA,綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的陰性對照siRNA是由非靶向任何已知的細(xì)胞mRNA的20-25個亂序核苷酸組成。 ②細(xì)胞培養(yǎng) 無菌取ICR小鼠的骨髓細(xì)胞,用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng),同時加入10ng/ml的GM-CSF以及10ng/ml的IL-4誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生,第2天及第4天進行半量換液。第6天,收集細(xì)胞,按2×105/孔加入24孔板中,370C5%CO2培養(yǎng)24小時,將其分為siRNA轉(zhuǎn)染組(A)、陰性對照組(B)、空白對照組(C)FAM標(biāo)記的陰性對照組(D)。 ③轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine2000包裹siRNA并轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞,抑制共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達。 ④轉(zhuǎn)染效率檢測 共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的形態(tài)以及初步判斷轉(zhuǎn)染效率。 ⑤流式細(xì)胞術(shù) 檢測轉(zhuǎn)染效率以及各組骨髓樹突狀細(xì)胞的表面CD11c,CD80,CD86,CD40,MHC-Ⅱ的表達。 ⑥r(nóng)t-PCR 檢測基因水平上CD80、CD86、CD40的表達情況,觀察CD80/86/40特異的siRNA引起的靶細(xì)胞內(nèi)目的基因的沉默效果。 ⑦混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 無菌分離ICR小鼠的脾淋巴細(xì)胞,于10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3個小時,收集懸浮細(xì)胞作為T淋巴細(xì)胞,按1:5的比例將T淋巴細(xì)胞和25ug/ml的絲裂霉素C滅活的樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng),同時加入20ug/ml的胰島素B9-23多肽,370C 5%CO2培養(yǎng)72小時,在培養(yǎng)結(jié)束前的18小時,加入3H-Tdr,送同位素科檢測CPM值。 ⑧細(xì)胞因子檢測 收集各組混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測細(xì)胞因子IL-10和IFN-γ的水平。 結(jié)果: ①共聚焦顯微鏡下觀察約80%的細(xì)胞內(nèi)具有綠色熒光。②流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率為79.92%,各組BMDC的CD11c的表達均在60%以上,與B、C兩組相比,A組CD80、CD86、CD40的表達降低,但是并沒有顯著差異。 ③rt-PCR的結(jié)果顯示,A組的CD80、CD86、CD40的表達下調(diào)。 ④混合淋巴細(xì)胞反應(yīng):A組、B組、C組的CPM值分別為2424.67±169.36、7484.33±133.44、7735.33±539.87,A組樹突狀細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著低于B組和C組,p0.01。 ⑤細(xì)胞因子的檢測:A組、B組、C組樹突狀細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分泌的IL-10(pg/ml)的水平分別為522.72±6.92、483.40±4.70、483.91±6.82,分泌的IFN-γ(pg/ml)的水平分別為1654.95±39.79、1971.76±62.85、1936.87±61.96,A組與B、C兩組相比,T淋巴細(xì)胞分泌較多的IL-10以及較少的IFN-γ,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。 結(jié)論: 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)能夠有效抑制小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達,制備出耐受性樹突狀細(xì)胞。經(jīng)胰島素B9-23多肽負(fù)載后,具有較弱的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力,并且誘導(dǎo)初始T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化,分泌較多的IL-10,而IFN-γ的分泌顯著減少。這些研究表明,胰島素B9-23多肽體外負(fù)載耐受性樹突狀細(xì)胞通過誘導(dǎo)T細(xì)胞無能、使其向Th2方向分化而發(fā)揮致免疫耐受作用,對自身免疫性糖尿病的早期防治具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張臨友,高源;設(shè)計樹突狀細(xì)胞疫苗誘發(fā)外周免疫耐受治療自身免疫疾病[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2004年02期

2 ;Immune tolerance induced by adoptive transfer of dendritic cells in an insulin-dependent diabetes mellitus murine model[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年01期

3 付必莽;何曉順;余思;胡安斌;馬毅;黃潔夫;;小鼠骨髓源半成熟樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與初步鑒定[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2008年04期

本文編號：2020359