背景和目的: 1型糖尿病被認為是由T淋巴細胞介導的選擇性破壞胰島β細胞的一種自身免疫性疾病。T1DM患者一旦出現明顯的臨床癥狀,約有80%的胰島已經被破壞,因此強調T1DM的早期診斷和早期預防的意義顯得尤為重要。一系列的自身抗原包括胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島素瘤相關蛋白2(IA-2)、鋅轉運體8(ZnT8)等被認為是啟動自身免疫反應的靶抗原。同時,一些細胞因子、趨化因子及炎癥介質也參與了該自身免疫過程。其中,可產生IFN-γ等細胞因子的Th1型細胞是致病性T細胞,而Th2型T細胞通過釋放IL-4和IL-10介導糖尿病的免疫保護作用。在應用NOD鼠的研究中證實,胰島素/前胰島素尤其是胰島素B9~23肽段是啟動NOD鼠自身免疫性糖尿病的最主要的自身抗原[1]。借助于NOD鼠模型,應用胰島素或胰島素多肽進行了大量的抗原特異性免疫治療的研究,如鼻內或皮下給予胰島素B9-23多肽或改變的胰島素B9-23多肽可以延緩自身免疫性糖尿病的發(fā)展[2-3].但這個過程一般都需要借助于免疫佐劑的作用來刺激并增強抗原的免疫原性,單獨應用抗原本身可能不足以被抗原遞呈細胞所遞呈,誘導免疫耐受。本研究著眼于抗原與抗原遞呈細胞之間的相互作用,應用胰島素B9-23多肽體外負載DCs,探討其在誘導自身免疫耐受中的作用及相關機制。 樹突狀細胞(dendritic cells , DCs)是體內最重要的專職性抗原遞呈細胞,在自身免疫性糖尿病的發(fā)病過程中具有重要的作用,同時,DCs在維持機體的中樞免疫耐受和外周免疫耐受中也發(fā)揮著極其重要的作用[4],因而對自身免疫性疾病的治療也具有重要的意義。在穩(wěn)定狀態(tài)下,DCs表達低水平的共刺激分子,具有較強的攝取抗原的能力,但刺激T淋巴細胞增殖的能力較弱,從而誘導機體的免疫耐受。DCs提供T淋巴細胞活化所必需的3個信號[5]。第一信號為DCs提呈的抗原肽-MHC分子復合物與T細胞受體(TCR)的結合;第二信號為DCs表面的協同刺激分子與T細胞表面相應受體的結合;第三信號為DCs分泌的細胞因子促使活化的抗原特異性T淋巴細胞分化為不同的效應性T細胞亞群。只有當這些信號同時具備時,初始T淋巴細胞才能被有效地激活成為效應性T細胞,發(fā)揮免疫效應功能,如果缺乏有效的第二信號,抗原特異性T淋巴細胞將發(fā)生調亡或被誘導成無能狀態(tài),形成免疫耐受。DCs表面表達的CD40、CD80、CD86是與T淋巴細胞表面相應受體CD40L以及CD28分子結合的最主要的協同刺激分子,本研究應用RNAi技術有效沉默共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達,使其處于發(fā)育的不成熟階段,然后體外負載胰島素B9-23多肽,制備出致耐受性DCs疫苗,觀察其對同種異體小鼠脾臟T淋巴細胞的作用,進而探討其在自身免疫性糖尿病的預防和治療中的作用,為自身免疫性糖尿病的防治提供重要的實驗依據。 方法: ①siRNA合成 設計并合成針對小鼠骨髓樹突狀細胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的特異性siRNA,綠色熒光蛋白(GFP)標記的陰性對照siRNA是由非靶向任何已知的細胞mRNA的20-25個亂序核苷酸組成。 ②細胞培養(yǎng) 無菌取ICR小鼠的骨髓細胞,用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng),同時加入10ng/ml的GM-CSF以及10ng/ml的IL-4誘導樹突狀細胞的產生,第2天及第4天進行半量換液。第6天,收集細胞,按2×105/孔加入24孔板中,370C5%CO2培養(yǎng)24小時,將其分為siRNA轉染組(A)、陰性對照組(B)、空白對照組(C)FAM標記的陰性對照組(D)。 ③轉染 用Lipofectamine2000包裹siRNA并轉染樹突狀細胞,抑制共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達。 ④轉染效率檢測 共聚焦顯微鏡觀察轉染后的形態(tài)以及初步判斷轉染效率。 ⑤流式細胞術 檢測轉染效率以及各組骨髓樹突狀細胞的表面CD11c,CD80,CD86,CD40,MHC-Ⅱ的表達。 ⑥rt-PCR 檢測基因水平上CD80、CD86、CD40的表達情況,觀察CD80/86/40特異的siRNA引起的靶細胞內目的基因的沉默效果。 ⑦混合淋巴細胞反應 無菌分離ICR小鼠的脾淋巴細胞,于10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3個小時,收集懸浮細胞作為T淋巴細胞,按1:5的比例將T淋巴細胞和25ug/ml的絲裂霉素C滅活的樹突狀細胞混合培養(yǎng),同時加入20ug/ml的胰島素B9-23多肽,370C 5%CO2培養(yǎng)72小時,在培養(yǎng)結束前的18小時,加入3H-Tdr,送同位素科檢測CPM值。 ⑧細胞因子檢測 收集各組混合淋巴細胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測細胞因子IL-10和IFN-γ的水平。 結果: ①共聚焦顯微鏡下觀察約80%的細胞內具有綠色熒光。②流式細胞術檢測轉染效率為79.92%,各組BMDC的CD11c的表達均在60%以上,與B、C兩組相比,A組CD80、CD86、CD40的表達降低,但是并沒有顯著差異。 ③rt-PCR的結果顯示,A組的CD80、CD86、CD40的表達下調。 ④混合淋巴細胞反應:A組、B組、C組的CPM值分別為2424.67±169.36、7484.33±133.44、7735.33±539.87,A組樹突狀細胞刺激T淋巴細胞增殖的能力顯著低于B組和C組,p0.01。 ⑤細胞因子的檢測:A組、B組、C組樹突狀細胞刺激T淋巴細胞分泌的IL-10(pg/ml)的水平分別為522.72±6.92、483.40±4.70、483.91±6.82,分泌的IFN-γ(pg/ml)的水平分別為1654.95±39.79、1971.76±62.85、1936.87±61.96,A組與B、C兩組相比,T淋巴細胞分泌較多的IL-10以及較少的IFN-γ,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。 結論: 應用RNA干擾技術能夠有效抑制小鼠骨髓來源的樹突狀細胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達,制備出耐受性樹突狀細胞。經胰島素B9-23多肽負載后,具有較弱的刺激T淋巴細胞增殖的能力,并且誘導初始T淋巴細胞向Th2方向分化,分泌較多的IL-10,而IFN-γ的分泌顯著減少。這些研究表明,胰島素B9-23多肽體外負載耐受性樹突狀細胞通過誘導T細胞無能、使其向Th2方向分化而發(fā)揮致免疫耐受作用,對自身免疫性糖尿病的早期防治具有重要的意義。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 張臨友,高源;設計樹突狀細胞疫苗誘發(fā)外周免疫耐受治療自身免疫疾病[J];國外醫(yī)學(免疫學分冊);2004年02期

2 ;Immune tolerance induced by adoptive transfer of dendritic cells in an insulin-dependent diabetes mellitus murine model[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年01期

3 付必莽;何曉順;余思;胡安斌;馬毅;黃潔夫;;小鼠骨髓源半成熟樹突狀細胞的培養(yǎng)與初步鑒定[J];中國醫(yī)學科學院學報;2008年04期

本文編號：2020359