本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠重癥急性胰腺炎肺組織E-選擇素表達(dá)的影響和意義

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【摘要】：重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是病情復(fù)雜險重、并發(fā)癥累及廣泛、病死率較高的難治性疾病。急性期易誘發(fā)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，引起毛細(xì)血管膜彌散性破壞，出現(xiàn)肺水腫和肺不張，病情發(fā)展導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，目前臨床治療仍缺乏特異性和有效性。因此，ALI是SAP最常見、最嚴(yán)重全身并發(fā)癥之一。肺富含大量毛細(xì)血管，血流豐富，SAP時過度釋放入血的炎癥介質(zhì)易導(dǎo)致肺成為炎性損傷最嚴(yán)重、最主要的靶器官之一。其中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary vascular endothelial cells，PVEC)又是肺損傷時受累的重要靶細(xì)胞，病理狀態(tài)下，PVEC上異常表達(dá)的物質(zhì)能促進(jìn)血管內(nèi)循環(huán)的白細(xì)胞與其發(fā)生相互作用，進(jìn)而使白細(xì)胞附壁，破壞PVEC，并向血管外遷移，這是導(dǎo)致肺損傷的重要環(huán)節(jié)。E-選擇素(E-selectin，Es)參與介導(dǎo)此過程，PVEC活性增加時，其Es表達(dá)增高，而PVEC活性增加是血管病變的重要階段。因此，PVEC上Es的高表達(dá)有助于提示肺血管病變早期內(nèi)皮細(xì)胞活化程度，是內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷的征兆。最近研究報道，成體組織來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrowMesenchymal Stem Cells，BMSCs)對ALI具有免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)微環(huán)境或替代損傷的肺組織細(xì)胞等生物學(xué)功能。本課題以大鼠SAP模型為研究對象，觀察肺組織Es動態(tài)變化特點(diǎn)。經(jīng)靜脈移植同種異體BMSCs，觀察其在損傷肺組織的分布定植，探討B(tài)MSCs移植對SAP大鼠肺組織Es表達(dá)及部分細(xì)胞因子水平的影響和意義。 【目的】 1.建立可靠、簡便、重復(fù)性好，具有顯著ALI表現(xiàn)的SAP動物模型，了解大鼠SAP模型病程規(guī)律及病理改變，為下步實(shí)驗(yàn)研究提供良好的動物模型基礎(chǔ)。 2.分析逆行膽胰管注射法制作的大鼠SAP模型誘發(fā)肺損傷嚴(yán)重程度，并探討該模型下肺組織Es變化規(guī)律，為下步SAP肺損傷的干預(yù)研究提供依據(jù)。 3.建立體外分離、純化、快速擴(kuò)增SD大鼠BMSCs的科學(xué)方法，以獲得足夠BMSCs，并分析部分表型特征。為下步運(yùn)用BMSCs移植治療SAP肺損傷模型的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)材料。 4.通過BMSCs移植干預(yù)大鼠SAP模型誘發(fā)的肺損傷，檢測肺組織Es含量、炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β水平等。探討B(tài)MSCs能否可通過抑制肺組織Es表達(dá)及炎癥介質(zhì)釋放，對SAP肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。 【方法】 1.經(jīng)膽胰管逆行注射5%脫氧�；悄懰徕c建立SAP模型：清潔級雄性SD大鼠，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(SAP)和假手術(shù)組(SO)。10%水合氯醛腹腔麻醉，暴露胰腺，辨認(rèn)膽胰管，夾閉靠近肝門段的膽胰管，經(jīng)膽胰管逆行注射5%脫氧牛磺膽酸鈉，縫扎膽胰管遠(yuǎn)端；SO組僅翻動按摩胰腺。術(shù)后補(bǔ)液支持。觀察2組大鼠48h生存質(zhì)量，于3h、6h、12h、24h分批處死大鼠，分析血清淀粉酶、白蛋白、Ca~(2+)水平及胰腺病理改變。評價該模型嚴(yán)重程度和制作方式的可行性。 2.清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(SAP)、假手術(shù)組(SO)，膽胰管逆行注射5%脫氧�；悄懰徕c制作大鼠SAP模型。觀察3h，6h，12h，24h兩組動物肺濕/干重比，肺組織病理改變；實(shí)時熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法觀察肺組織Es變化。 3.全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)獲取BMSCs：無菌條件下，分離幼齡SD大鼠雙側(cè)脛股骨。DMEM/F12緩慢沖洗骨髓腔，離心骨髓細(xì)胞懸液，用1%青鏈霉素-10%FBS的DMEM/F12吹打重懸，以2×10~5/m1接種于25cm~2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。靜置于37°C，飽和濕度，5%CO_2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，并按1:2或1:3傳代擴(kuò)增。收獲生長良好的第3代細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD29~+CD90~+CD34~-CD45~-細(xì)胞群，分析BMSCs純度。 4.逆行膽胰管注射5%脫氧牛磺膽酸鈉制作大鼠SAP模型，隨機(jī)取4只用于BMSCs示蹤觀察，其余隨機(jī)分成對照組(Control-SAP)、BMSCs治療組(BMSCs-SAP)和MP治療組(MP-SAP)。P3代BMSCs制成1×10~6/ml細(xì)胞懸液，建模后1h經(jīng)尾靜脈按1ml細(xì)胞懸液/100g體重輸注大鼠體內(nèi)(干細(xì)胞示蹤大鼠輸入CM-DiI標(biāo)記的BMSCs)；對照組和MP治療組分別注射等體積量生理鹽水和MP。觀察3h、6h、12h、24h各組大鼠血清淀粉酶、白蛋白、TNF-α、IL-1β水平，肺濕/干重比；肺與胰腺組織病理改變；實(shí)時熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法分析肺組織Es表達(dá)變化。BMSCs示蹤大鼠取肺組織快速冰凍，熒光顯微鏡下觀察CM-DiI陽性細(xì)胞(BMSCs)分布。 【結(jié)果】 1. SAP組大鼠表現(xiàn)為弓背、蜷曲、豎毛、不喜動、呼吸困難等。腹腔血性腹水，胰腺膠凍樣壞死及皂化斑；病理顯示胰腺組織間隙增大，炎癥細(xì)胞浸潤，微血管破裂出血，腺泡細(xì)胞壞死，腺體結(jié)構(gòu)破壞等。與SO組同期相比，SAP組大鼠胰腺病理學(xué)評分、血清淀粉酶明顯升高；白蛋白、Ca~(2+)水平降低(p0.05)，大鼠生存率下降。 2.與SO組大鼠相比，SAP組大鼠出現(xiàn)進(jìn)行性加重的呼吸衰竭表現(xiàn)，病理顯示肺泡間隔增寬、炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)滲液、出血，肺泡萎陷不張、部分實(shí)變等；肺濕/干重比及病理學(xué)評分增高。實(shí)時熒光定量PCR分析，SAP組大鼠肺組織EsmRNA在3h即明顯增加，6h達(dá)高峰；免疫熒光組織化學(xué)顯示，Es蛋白分布于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜及胞漿中，表達(dá)程度較Es mRNA變化延遲，但趨勢較為相符。 3.培養(yǎng)的原代細(xì)胞24h后可見絕大多數(shù)已貼壁，呈多角形、紡錘樣等混合形態(tài)，至7~8d細(xì)胞匯合達(dá)90％，部分聚集形成集落。定期換液和傳代，細(xì)胞純化。第3代細(xì)胞形態(tài)均一，多呈稍寬的長梭形，類似成纖維樣，“漩渦狀”排列增多。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：CD29~+CD90~+CD34~-CD45~-細(xì)胞群占91.3%以上。免疫表型符合BMSCs表面抗原特征，為SAP模型肺組織Es干預(yù)研究提供細(xì)胞來源。 4.經(jīng)BMSCs移植的SAP大鼠精神好轉(zhuǎn)，呼吸較平穩(wěn)，口鼻無粉紅色泡沫出現(xiàn)，48h生存率顯著提高。熒光顯微鏡下，肺組織CM-DiI陽性細(xì)胞(BMSCs)分布呈時序性增加。與Control-SAP組相比，肺組織Es mRNA、Es蛋白表達(dá)及肺濕/干重比降低，胰腺和肺病理損害減輕；血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β等水平顯著降低，白蛋白升高。但BMSCs治療效果幾乎均顯著差于MP治療組(p0.05)。 【結(jié)論】 1.采用經(jīng)膽胰管逆行注射5%脫氧�；悄懰徕c的方法建立SAP模型，可以引起胰腺嚴(yán)重的病理損害，出現(xiàn)SAP呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥等相應(yīng)臨床表現(xiàn)。模型制作方法可靠易行，成功率高，適合作為研究對象。 2. SAP早期誘發(fā)不可逆的肺病理損傷及相應(yīng)肺功能損害表現(xiàn)。SAP肺損傷時導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上E-選擇素表達(dá)增加極早出現(xiàn)，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上Es表達(dá)變化陡增后緩慢下降。Es介導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)壁的滾動、附壁及遷移外滲過程。Es的增高早期反映了肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和內(nèi)皮屏障功能失衡。 3.經(jīng)全骨髓差異貼壁法獲取純度較高的BMSCs，流式細(xì)胞儀鑒定符合BMSCs細(xì)胞表面抗原特征，P3代BMSCs含量達(dá)到91.3%以上。說明此法簡單、適用、高效，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了充足的BMSCs來源。 4.同種異體BMSCs可遷移至SAP大鼠受損的肺組織，發(fā)揮保護(hù)與修復(fù)作用。BMSCs調(diào)節(jié)大鼠SAP時全身炎癥反應(yīng)，抑制炎癥介質(zhì)過度釋放，減輕肺免疫損傷；同時，降低肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，減少Es表達(dá)，阻止Es介導(dǎo)下白細(xì)胞與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及外滲，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)肺血管內(nèi)皮屏障功能修復(fù)，有效阻止肺毛細(xì)血管內(nèi)物質(zhì)滲漏，改善肺功能。甲氫潑尼松琥珀酸鈉在SAP早期應(yīng)急療效明顯，，但BMSCs豐富的生物學(xué)功能使其在SAP后期組織修復(fù)中優(yōu)勢更為明顯。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 異體移植 模型 胰腺炎 肺損傷 內(nèi)皮細(xì)胞 E-選擇素 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R657.51;R-332
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 縮略詞表14-16
• 前言16-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一部分 重癥急性胰腺炎動物模型的建立20-33
• 一、材料和方法20-24
• 二、結(jié)果24-28
• 三 討論28-31
• 參考文獻(xiàn)31-33
• 第二部分 重癥急性胰腺炎動物模型肺損傷及肺組織 E-選擇素變化特點(diǎn)評估33-50
• 一、材料和方法33-37
• 二、結(jié)果37-45
• 三 討論45-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定50-63
• 一、材料和方法50-53
• 二、結(jié)果53-57
• 三、討論57-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 第四部分 同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對重癥急性胰腺炎肺組織 E-選擇素的干預(yù)作用63-92
• 一、材料和方法63-69
• 二、結(jié)果69-82
• 三、討論82-86
• 參考文獻(xiàn)86-92
• 全文結(jié)論92-93
• 綜述 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對急性胰腺炎與肺損傷作用機(jī)制的研究93-101
• 參考文獻(xiàn)98-101
• 發(fā)表論文101-102
• 致謝102

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：981603