發(fā)布時(shí)間：2017-10-06 09:13

  本文關(guān)鍵詞：不同血清微環(huán)境培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及體外標(biāo)記

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【摘要】：在骨髓基質(zhì)中存在非造血細(xì)胞稱(chēng)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或祖細(xì)胞。這種細(xì)胞在體內(nèi)外均能增殖和誘導(dǎo)分化成其他組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌健、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和造血間質(zhì)細(xì)胞等。這些細(xì)胞具有多向分化潛能、自我更新、高度增殖能力、易獲得、自體損傷小、免疫原性弱、自體移植不發(fā)生排斥反應(yīng)等特點(diǎn),越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)研究者的青睞。目前在分子和細(xì)胞水平有大量的有效數(shù)據(jù)證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以應(yīng)用于細(xì)胞替代治療、組織器官移植和基因治療等,是一種良好的替代治療的靶細(xì)胞,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。但是骨髓中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含量極少,只占整個(gè)骨髓中有核細(xì)胞的十萬(wàn)分之一,并隨年齡增加而減少,同時(shí)骨髓還含有其他多種細(xì)胞成分,因此如何獲取體外分離、純化和擴(kuò)增較高純度和數(shù)量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前亟待解決的問(wèn)題。本文主要通過(guò)體外培養(yǎng)觀察不同微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增值狀態(tài)及純度,尋找比較適合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外生長(zhǎng)的微環(huán)境,對(duì)其進(jìn)行體外標(biāo)記,為以后進(jìn)行活體內(nèi)移植標(biāo)記追蹤打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的 觀察四種不同血清微環(huán)境對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響。改良體外培養(yǎng)BMSCs的培養(yǎng)條件。用Hoechst33342標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞,尋找合適的體外標(biāo)記方法,為MSCs進(jìn)行活體體內(nèi)移植標(biāo)記追蹤打下基礎(chǔ)。 方法 選取6-8周齡SD雄性大鼠,從大鼠股骨、脛骨中提取細(xì)胞,采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)。體外分為四種培養(yǎng)方式：第一組(自身血清組)：原代細(xì)胞用含10%自身血清培養(yǎng)液培養(yǎng),開(kāi)始傳代后換用含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)；第二組(同種異體血清組)：原代細(xì)胞用含10%同種異體血清培養(yǎng)液培養(yǎng),傳代后用含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。第三組(胎牛血清組)：原代和傳代后的細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)；第四組(無(wú)血清組)：原代細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng),傳代后用含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD34和CD44的陽(yáng)性表達(dá)率,Hoechst33342標(biāo)記法標(biāo)記觀察細(xì)胞的標(biāo)記率,及熒光持續(xù)時(shí)間及標(biāo)記對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 1.顯微鏡下觀察大鼠自身血清微環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一,呈長(zhǎng)梭形,集落式或旋渦狀生長(zhǎng),數(shù)量較多,第二組細(xì)胞形態(tài)與第一組相似,都具有高的純合度和較短的首次傳代時(shí)間�；A(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)下的細(xì)胞較稀少,只有稍許集落式生長(zhǎng)。2.生長(zhǎng)曲線圖體現(xiàn)出自身血清組細(xì)胞倍增速度快于同種異體血清組和胎牛血清組,無(wú)血清組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢無(wú)明顯倍增速率。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)果顯示：前三組細(xì)胞CD44陽(yáng)性表達(dá)率較高,均在95%以上,而無(wú)血清培養(yǎng)條件下CD44陽(yáng)性表達(dá)率在65.79%。這說(shuō)明含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞純度比不含血清組高4.大鼠MSCs經(jīng)Hoechst33342標(biāo)記后細(xì)胞核都在紫外光激發(fā)下顯示亮藍(lán)色,Hoechst33342的標(biāo)記率幾乎達(dá)到100%。標(biāo)記上Hoechst33342的大鼠骨髓MSCs仍然可以繼續(xù)增值生長(zhǎng),隨著分裂代數(shù)的增多,熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)酢?周后仍可見(jiàn)淡淡的熒光。 結(jié)論 自身血清組培養(yǎng)的細(xì)胞具有形態(tài)均一性好、純合度高、首次傳代時(shí)間短、倍增速率快等優(yōu)點(diǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大鼠自身血清微環(huán)境培養(yǎng)條件下更有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁、增值及純化。用Hoechst33342體外標(biāo)記BMSCs效果好,標(biāo)記率高且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增值無(wú)明顯影響,提示Hoechst可作為體外BMSCs研究的標(biāo)記物,為MSCs進(jìn)行活體體內(nèi)移植標(biāo)記追蹤打下基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 微環(huán)境 體外培養(yǎng) 大鼠 純化 標(biāo)記
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文縮寫(xiě)詞索引11-12
• 1 前言12-15
• 2 實(shí)驗(yàn)材料15-19
• 3 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 4 結(jié)果23-26
• 5 討論26-32
• 6 結(jié)論32-33
• 7 附圖33-38
• 8 參考文獻(xiàn)38-41
• 綜述 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展41-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在讀期間發(fā)表的論文55-56
• 致謝56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周新伏;曠文勇;羅自勉;張廣森;符桑;劉利華;唐鐵鋼;李佳元;陳紹芳;;臍帶血清體外培養(yǎng)臨床應(yīng)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法研究[J];臨床血液學(xué)雜志;2008年05期

2 朱建宇;施偉民;;小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年05期

3 高福來(lái);韓明子;金世柱;胡宗晶;車(chē)德馨;;骨髓干細(xì)胞分離技術(shù)的探討[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2010年06期

4 劉品端,王偉,梅晰凡;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)貼壁分離和消化控制相結(jié)合可否為簡(jiǎn)便高效的技術(shù)方法[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年18期

5 王文;李靜;王宗仁;張金洲;師長(zhǎng)宏;;不同分離方法與培養(yǎng)條件下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況比較[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年03期

6 莊淑波;劉毅;陳克明;肖斌;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、純化與培養(yǎng)適宜條件的篩選[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年20期

7 張芳;盛望;王小利;李澤琳;;葡萄糖對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年01期

8 張才龍;夏長(zhǎng)所;蔣正堯;;應(yīng)用密度梯度離心和貼壁篩選法分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(英文)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年06期

9 史德剛;栗國(guó)梁;張積仁;黃忠琴;許灼新;陳志維;陳遜文;;重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染對(duì)于骨髓源性成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性及對(duì)血管生成的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年33期

10 秦賀;楊仕明;趙立東;鄭貴亮;郭維維;陳光濤;翟所強(qiáng);;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與初步鑒定[J];中華耳科學(xué)雜志;2009年04期

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本文編號(hào)：981938