發(fā)布時間：2017-09-25 23:30

  本文關(guān)鍵詞：利用TALEN雙修飾敲除位于AT-豐富區(qū)脆性位點基因FATS的小鼠模型研究

  更多相關(guān)文章： 普通型脆性位點 TALEN 移碼突變 基因敲除

【摘要】：目的 轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)作為一種新的基因修飾方法,自2011年以來成功應(yīng)用于基因修飾以及動物模型的產(chǎn)生。FATS基因?qū)儆诖嘈晕稽c基因,其編碼序列位于基因組中AT富含區(qū),特別是其有重要功能的最大外顯子被含有重復(fù)序列的大片段AT富含區(qū)所包圍,難以用常規(guī)胚胎干細胞同源重組方法實現(xiàn)定位敲除。為了建立FATS基因敲除小鼠模型,我們通過構(gòu)建’TALEN打靶載體,并創(chuàng)新性地用TALEN雙修飾法進行FATS基因敲除,探索高效建立基因敲除小鼠模型的新途徑。 方法 1.采用生物信息學(xué)方法分析小鼠的FATS基因的編碼序列,確定打靶載體的設(shè)計位點。針對其最大外顯子部位設(shè)計兩對TALEN載體,確保打靶成功率。 2.一采用Golden Gate的方法組裝TALEN打靶載體,載體組裝完成后通過PCR和測序驗證打靶載體是否正確,將序列正確的克隆進行質(zhì)粒DNA提取和純化。 3.將FATS-TALEN打靶質(zhì)粒DNA通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染小鼠HC11細胞,72小時后提取細胞基因組DNA,進行T7E1酶切實驗,并通過T-A克隆測序驗證FATS-TALEN打靶載體在細胞水平上的體外切割效率。 4.體外鑒定FATS-TALEN載體有效后,將打靶載體DNA酶切線性化,通過T7轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄成具有5’帽子和3'polyA尾巴的成熟mRNA。對小鼠單細胞期受精卵進行原核注射,注射后的受精卵移植到假孕母鼠體內(nèi)。 5.待小鼠出生后,剪腳趾編號進行基因鑒定,確定陽性小鼠(FO, founder)。同時檢測FATS-TALEN打靶載體在這些F0小鼠中是否有打靶非特異性(off-target)情況。 6.將陽性小鼠和野生型小鼠交配,得到雜合的F1代小鼠,F1代小鼠自交得到純合的FATS基因敲除小鼠。 7.分別取一月齡的野生型小鼠、雜合小鼠、純合小鼠睪丸提取蛋白質(zhì)裂解液,通過Western blot檢測FATS蛋白的表達情況。 結(jié)果 1.細胞實驗結(jié)果證實,設(shè)計的兩對TALEN都具有雙鏈切割活性,通過TA克隆證實兩對TALEN打靶載體的體外效率分別為25%和4.5%。 2.兩對TALEN打靶載體的體內(nèi)致突變效率分別為17.2%和14.3%。在單對FATS-TALEN mRNA濃度不變的情況下,兩對FATS-TALEN打靶載體同時注射到單細胞期的小鼠受精卵中,可以將陽性founder小鼠的比例增加到61.5%。并且通過兩對TALEN的同時切割,實現(xiàn)了TALEN介導(dǎo)的染色體DNA長片段的缺失。 3.T7E1酶切實驗和測序結(jié)果證明TALEN具有很好的特異性和專一性,通過對全基因組相似序列的檢測,沒有檢測到off-target現(xiàn)象。 4.由TALEN引起的基因敲除可以通過生殖細胞傳給下一代小鼠。 5.通過Western blot實驗證明在雜合基因敲除的小鼠體內(nèi),FATS基因的蛋白表達水平降低；在純合基因敲除的小鼠體內(nèi),FATS基因的蛋白表達沉默。 結(jié)論 1.在每對FATS-TALEN mRNA濃度不變的情況下,兩對TALEN同時注射可以顯著提高陽性小鼠的比率,同時可以造成長片段的缺失突變,方便PCR快速鑒定。 2. TALEN打靶載體具有很好的特異性,并且由TALEN引起的突變可由生殖細胞傳給F1代小鼠。因此,TALEN雙修飾技術(shù)進一步增強TALEN單修飾技術(shù)建立基因敲除模型的有效性和實用性,對脆性位點基因功能的系統(tǒng)性研究有深遠的促進作用。
【關(guān)鍵詞】：普通型脆性位點 TALEN 移碼突變 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 對象和方法13-27
• 1.1 實驗材料13-17
• 1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細胞系13
• 1.1.2 主要試劑及配制13-16
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備16-17
• 1.2 實驗方法17-27
• 1.2.1 打靶載體質(zhì)粒的構(gòu)建17-19
• 1.2.2 TALEN打靶載體體外效率的驗19-21
• 1.2.3 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄21-23
• 1.2.4 T7EN1實驗及TA克隆23-24
• 1.2.5 RT-PCR24-25
• 1.2.6 Western Blot實驗25-27
• 結(jié)果27-38
• 2.1 打靶載體的組裝和體外效率的驗證27-29
• 2.2 打靶載體的體外轉(zhuǎn)錄和knockout小鼠的鑒定29-34
• 2.3 Founder小鼠的off-target檢測和傳代34-37
• 2.4 FATS蛋白在蛋白水平上表達的檢測37-38
• 討論38-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻42-45
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明45-46
• 綜述 翻譯起始因子eIF4E的分子功能與研究進展46-63
• 綜述參考文獻57-63
• 致謝63

【共引文獻】

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本文編號：920242