本文關(guān)鍵詞：腸病毒71型非結(jié)構(gòu)蛋白3A定位機(jī)制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 腸道病毒71型 3A 感染性克隆 多克隆抗體 定位 ASNA1

【摘要】：腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在全世界廣泛流行,感染人類后可以引起手足口病以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害在內(nèi)的一系列疾病。腸道病毒感染細(xì)胞后可以產(chǎn)生大量的囊泡結(jié)構(gòu)作為病毒的復(fù)制工廠。胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)重構(gòu)和這些囊泡產(chǎn)生的機(jī)制目前還不明確,可能與病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的功能有關(guān)。腸道病毒3A蛋白是一個(gè)囊泡膜結(jié)合蛋白,但它如何定位到膜,是否參與囊泡發(fā)生以及可能的機(jī)制還不是很清楚。 本論文研究內(nèi)容主要包括三個(gè)部分： 第一部分：EV71全長感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建。提取EV71RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,利用特異性引物分別PCR擴(kuò)增3個(gè)首尾重疊的基因片段,克隆到pBluescriptII載體上,最后將三個(gè)目的片段按順序依次克隆至pBluescript Ⅱ載體上,構(gòu)建T7啟動(dòng)子控制的全長感染性克隆質(zhì)粒,為以后該病毒的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 第二部分：EV713A蛋白的原核表達(dá)及抗體制備。PCR擴(kuò)增的3A基因克隆到PET28a載體上構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒PET28a-3A并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,誘導(dǎo)表達(dá)3A重組蛋白,免疫小鼠制備3A抗體。結(jié)果顯示3A蛋白主要以包涵體的形式存在；免疫熒光和、Vestern blot檢測顯示,制備的3A蛋白鼠源抗體可識(shí)別真核表達(dá)的EGFP-3A融合蛋白以及EV71感染細(xì)胞表達(dá)的3A蛋白,表明成功制備了特異性的EV713A蛋白的鼠源抗體。 第三部分：3A蛋白定位機(jī)制的初步研究。構(gòu)建3a基因及其不同缺失突變體羧基末端GFP融合蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后分析在細(xì)胞中的定位。結(jié)果顯示3A蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中,且跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TMD)是3A蛋白定位到囊泡膜的信號。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞內(nèi)的末端錨定結(jié)合蛋白ASNA1與3A蛋白相互作用,可能參與3A蛋白的定位。通過RNA干擾將ASNA1干擾后發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制受到一定程度的抑制,進(jìn)一步說明ASNA1可能對病毒的復(fù)制有影響。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒71型 3A 感染性克隆 多克隆抗體 定位 ASNA1
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-18
• 1.1 小RNA病毒科簡介11-12
• 1.1.1 小RNA病毒科特征11
• 1.1.2 小RNA病毒分類11
• 1.1.3 小RNA病毒基因組結(jié)構(gòu)11-12
• 1.1.4 小RNA病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)12
• 1.2 腸道病毒屬簡介12-13
• 1.2.1 腸道病毒屬理化特性12-13
• 1.2.2 腸道病毒屬分類13
• 1.3 EV71病毒簡介13-14
• 1.3.1 EV71病毒發(fā)現(xiàn)及流行病學(xué)13
• 1.3.2 EV71病毒的復(fù)制13-14
• 1.3.3 EV71非結(jié)構(gòu)蛋白3A14
• 1.4 蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式14-17
• 1.4.1 蛋白質(zhì)的兩類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑14-15
• 1.4.2 共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑15
• 1.4.3 翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)途徑15
• 1.4.4 TA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑15-17
• 1.5 本課題研究的目的和意義17-18
• 第二章 EV71全長感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建18-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.1.1 試劑18
• 2.1.2 儀器18
• 2.1.3 質(zhì)粒、菌株、病毒毒株和細(xì)胞18
• 2.1.4 溶液及培養(yǎng)基配方18-19
• 2.1.5 引物19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-24
• 2.2.1 EV71病毒RNA提取19-20
• 2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成病毒基因組cDNA20
• 2.2.3 質(zhì)粒提取20-21
• 2.2.4 EV71基因組01、02、03三個(gè)片段的PCR擴(kuò)增21-22
• 2.2.5 PCR擴(kuò)增目的片段純化22
• 2.2.6 目的片段和載體酶切22-23
• 2.2.7 目的片段與載體連接23
• 2.2.8 感受態(tài)細(xì)胞制備23
• 2.2.9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程23-24
• 2.2.10 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析24-27
• 2.3.1 EV71基因組片斷的PCR擴(kuò)增24-25
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pBluescript-01/02/03的構(gòu)建與鑒定25
• 2.3.3 重組質(zhì)粒pBluescript-01-02的構(gòu)建與鑒定25-26
• 2.3.4 重組質(zhì)粒pBluescript-01-02-03的構(gòu)建與鑒定26-27
• 2.4 討論27-28
• 第三章 EV71非結(jié)構(gòu)蛋白3A的原核表達(dá)與抗體制備28-36
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 3.1.1 試劑28
• 3.1.2 儀器28
• 3.1.3 菌株、質(zhì)粒、病毒毒株和細(xì)胞28
• 3.1.4 溶液配方28-29
• 3.1.5 引物29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 3.2.1 表達(dá)載體PET28a-3A構(gòu)建29-30
• 3.2.2 融合蛋白誘導(dǎo)30-31
• 3.2.3 蛋白質(zhì)Western Blotting鑒定31
• 3.2.4 3A抗體的制備31
• 3.2.5 Lipofactamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞31
• 3.2.6 細(xì)胞總蛋白提取31
• 3.2.7 細(xì)胞免疫熒光檢測31-32
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析32-35
• 3.3.1 3a基因的擴(kuò)增32
• 3.3.2 原核表達(dá)載體PET28a-3A的構(gòu)建與鑒定32-33
• 3.3.3 3A重組蛋白的表達(dá)與鑒定33-34
• 3.3.4 多克隆抗體制備與檢測34-35
• 3.4 討論35-36
• 第四章 3A蛋白定位機(jī)制的初步研究36-52
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料36-38
• 4.1.1 試劑36
• 4.1.2 儀器36
• 4.1.3 菌株、質(zhì)粒、毒株和細(xì)胞36
• 4.1.4 溶液配方36
• 4.1.5 引物36-38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 4.2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建38-39
• 4.2.2 免疫共沉淀(Co-IP)39
• 4.2.3 干擾RNA合成39-40
• 4.2.4 TCID_(50)測定40
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析40-50
• 4.3.1 3A不同結(jié)構(gòu)域GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定40-42
• 4.3.2 3A蛋白在細(xì)胞中的定位42-46
• 4.3.3 3A蛋白定位機(jī)制研究46-48
• 4.3.4 ASNA1蛋白對病毒復(fù)制影響48-50
• 4.4 討論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 碩士期間發(fā)表論文56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 薛青紅,劉湘濤,張彥明,韓雪清,謝慶閣;口蹄疫病毒3A基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J];微生物學(xué)報(bào);2002年05期

，

本文編號：867083