本文關(guān)鍵詞：空腸彎曲菌感染仔兔模型的建立及動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)基因的篩選

  更多相關(guān)文章： 空腸彎曲菌 仔兔模型 組織分布 免疫應(yīng)答 SCOTS 致病性

【摘要】：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni, Cj)是一種重要的食源性人獸共患病原菌。人感染Cj后主要引起細(xì)菌性胃腸炎(Bacterial gastroenteritis)和急性腹瀉,免疫力低下者會(huì)導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦炎、敗血癥等全身性疾病。但迄今為止,對(duì)Cj致病性方面的研究尚不很清楚,其主要原因是缺乏合適的動(dòng)物模型。本研究嘗試建立空腸彎曲菌感染仔兔腹瀉模型,探索該菌在仔兔模型體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布、免疫應(yīng)答規(guī)律及可能的感染機(jī)制；并利用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列方法鑒定了空腸彎曲菌在感染兔體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的基因,取得了滿意結(jié)果。 一、空腸彎曲菌致仔兔腹瀉模型的建立 本研究選用初生仔兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,因?yàn)橄啾葒X類動(dòng)物,兔在系統(tǒng)發(fā)育和生理構(gòu)造上更相似于人類,初生動(dòng)物還具有體內(nèi)清潔、體型小、方便飼養(yǎng)和易于管理等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得最佳建模條件,使用空腸彎曲菌NCTC11168為攻毒菌株,灌胃1×109CFU劑量感染經(jīng)西咪替丁(50mg/kg)預(yù)處理的2日齡,體重為40+2g的仔兔。通過收集臨床癥狀、病理變化、病原分離和致病性資料評(píng)價(jià)模型建立情況。結(jié)果顯示空腸彎曲菌可人工感染仔兔并引起自限性的、水樣腹瀉癥狀；剖檢發(fā)現(xiàn)主要病變是小腸積液、腸壁出現(xiàn)出血點(diǎn),盲腸、結(jié)腸腫大,腸腔內(nèi)充滿水樣內(nèi)容物；組織病理切片顯示盲腸黏膜出現(xiàn)壞死脫落,固有層小血管擴(kuò)張、充血。病原分離鑒定結(jié)果證實(shí)各臟器感染菌株均為Cj。劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示腹瀉疾病的程度與攻毒劑量、腸道細(xì)菌定植量正相關(guān),至少106CFU細(xì)菌可引起仔兔可觀察的腹瀉癥狀和各腸道的定植；至少104CFU細(xì)菌可引起盲腸和結(jié)腸的定植。不同來源空腸彎曲菌分離株對(duì)仔兔致病性存在明顯差異,說明該模型能夠有效評(píng)價(jià)Cj的毒力強(qiáng)弱。 二、空腸彎曲菌仔兔體內(nèi)感染動(dòng)態(tài)分析 本研究在建立上述模型的基礎(chǔ)上,分別在攻毒后12,24,36,48和60hr剖檢仔兔,利用細(xì)菌分離及PCR方法分析Cj在體內(nèi)各組織中的分布情況和變化規(guī)律；應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)觀察Cj侵入小腸上皮細(xì)胞后引起細(xì)胞形態(tài)變化規(guī)律；應(yīng)用real-time RT-PCR技術(shù)檢測Cj感染后仔兔小腸黏膜炎癥趨化因子、細(xì)胞因子、抗菌物質(zhì)和酶類的分泌量變化規(guī)律。研究結(jié)果顯示Cj侵入血液的速度很快,對(duì)肝臟、腎臟等實(shí)質(zhì)器官的黏附性無明顯差異,并在48hr后被清除；Cj在盲腸和結(jié)腸中定植時(shí)間大于60hr,定植量高達(dá)108CFU/go掃描和透射電子顯微鏡結(jié)果顯示Cj可黏附在腸絨毛,并在攻毒后24-36hr侵襲破壞部分上皮細(xì)胞；48-60hr可見部分上皮細(xì)胞脫落、凋亡,大量上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示感染后12hr可見IL-10和抗菌肽CAP-18的大量分泌,36hr時(shí)IL-18、CCL20分泌增加；60hr時(shí)IFN-y、IL-10、IL-8、iNOS發(fā)揮重要免疫作用。 三、選擇性捕獲空腸彎曲菌仔兔體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列 本研究以空腸彎曲菌NCTC11168菌株為研究對(duì)象,采用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(Selective capture of transcribed sequences, SCOTS)方法鑒定空腸彎曲菌NCTC11168在感染兔盲腸過程中細(xì)菌轉(zhuǎn)錄的基因序列。經(jīng)過總RNA分離、cDNAs合成、PCR擴(kuò)增、SCOTS、陽性克隆測序。結(jié)果共獲得9個(gè)轉(zhuǎn)錄序列,按照其編碼蛋白的功能分為4大類：新陳代謝蛋白、細(xì)胞表面蛋白、復(fù)制相關(guān)蛋白和應(yīng)激相關(guān)蛋白。利用real-time RT-PCR對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證,結(jié)果表明：pnp、katA、cj0609c、cj1481c和acs等5個(gè)基因與正常CCDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的11168菌株的基因轉(zhuǎn)錄水平相比,在感染兔盲腸組織中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)4.49-116倍,為進(jìn)一步闡明篩選到的體內(nèi)表達(dá)基因在Cj致病過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：空腸彎曲菌 仔兔模型 組織分布 免疫應(yīng)答 SCOTS 致病性
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R-332;R378.3
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 目錄7-10
• 符號(hào)說明10-11
• 第一章 綜述11-27
• 1 空腸彎曲菌病概述11-13
• 1.1 病原學(xué)11-12
• 1.2 流行病學(xué)12
• 1.3 臨床癥狀12-13
• 1.4 臨床治療13
• 2 空腸彎曲菌感染動(dòng)物模型研究進(jìn)展13-17
• 2.1 靈長類動(dòng)物13-14
• 2.2 雪貂(Mustela Pulourius Furo)14
• 2.3 仔豬(Piglet)14
• 2.4 兔(Rabbit)14-15
• 2.5 嚙齒類動(dòng)物15-16
• 2.6 雞16-17
• 2.7 展望17
• 3 細(xì)菌體內(nèi)毒力基因表達(dá)技術(shù)17-22
• 3.1 差異顯示RT-PCR(DD-RT-PCR)18
• 3.2 差異熒光誘導(dǎo)(DFI)18
• 3.3 DNA芯片技術(shù)(DNA chip technique)18-19
• 3.4 代表性差異分析技術(shù)(RDA)19
• 3.5 體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(IVET)19-20
• 3.6 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIAT)20
• 3.7 信號(hào)標(biāo)簽誘變技術(shù)(STM)20
• 3.8 抑制消減雜交技術(shù)(SSH)20
• 3.9 選擇性抗原捕獲轉(zhuǎn)錄序列(SCOTS)20-22
• 3.10 展望22
• 參考文獻(xiàn)22-27
• 第二章 空腸彎曲菌致仔兔腹瀉模型的建立27-42
• 1 材料27-28
• 1.1 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物27
• 1.2 主要試劑27-28
• 1.3 主要儀器28
• 2 方法28-31
• 2.1 菌株復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)28
• 2.2 攻毒方式28
• 2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)28-29
• 2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Cj感染率分析29
• 2.5 攻毒劑量的確定29
• 2.6 實(shí)驗(yàn)仔兔體重的影響29
• 2.7 感染仔兔模型的建立29-30
• 2.7.1 臨床觀察和樣品的采集29-30
• 2.7.2 感染動(dòng)物菌株分離與鑒定30
• 2.8 組織病理切片分析30
• 2.9 劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.10 不同來源空腸彎曲菌分離株對(duì)仔兔模型致病性評(píng)價(jià)31
• 3 結(jié)果31-38
• 3.0 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Cj感染率本底調(diào)查31
• 3.1 接種劑量31
• 3.2 仔兔體重31-32
• 3.3 臨床癥狀32
• 3.4 病理變化32-33
• 3.5 各臟器細(xì)菌的分離鑒定33-36
• 3.6 劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)36-37
• 3.7 不同來源空腸彎曲菌分離株對(duì)仔兔模型致病性評(píng)價(jià)37-38
• 4 討論38-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 第三章 空腸彎曲菌仔兔體內(nèi)感染動(dòng)態(tài)分析42-54
• 1 材料42-43
• 1.1 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42
• 1.2 主要試劑42-43
• 1.3 主要儀器43
• 2 方法43-46
• 2.1 動(dòng)物接種43
• 2.2 樣品采集和處理辦法43
• 2.3 細(xì)菌組織分布動(dòng)態(tài)檢測43-44
• 2.3.1 細(xì)菌在實(shí)質(zhì)性器官和血液中消長規(guī)律43
• 2.3.2 細(xì)菌在腸道中消長規(guī)律43-44
• 2.4 電子顯微鏡檢測44
• 2.4.1 掃描電子顯微鏡的觀察44
• 2.4.2 透射電子顯微鏡觀察44
• 2.5 感染后腸組織細(xì)胞因子分泌動(dòng)態(tài)變化分析44-46
• 2.5.1 樣品RNA提取44-46
• 2.5.2 熒光定量PCR46
• 3 結(jié)果46-50
• 3.1 感染組織中空腸彎曲菌的動(dòng)態(tài)分布46-48
• 3.2 空腸彎曲菌感染腸道掃描電鏡、透射電鏡觀察48-50
• 3.3 空腸彎曲菌感染宿主天然免疫應(yīng)答50
• 4 討論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 第四章 選擇性捕獲空腸彎曲菌仔兔體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列54-69
• 1 材料54-56
• 1.0 菌株和質(zhì)粒54
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物試驗(yàn)54-55
• 1.2 主要試劑55
• 1.3 主要儀器55
• 1.4 引物55-56
• 2 方法56-62
• 2.1 空腸彎曲菌基因組DNA的提取56
• 2.2 空腸彎曲菌rDNA的克隆與鑒定56-58
• 2.3 RNA的分離、cDNA的合成、PCR擴(kuò)增58-60
• 2.3.1 RNA的提取與純化58-59
• 2.3.2 cDNA第一鏈的合成59
• 2.3.3 cDNA第二鏈的合成59
• 2.3.4 PCR反應(yīng)59-60
• 2.4 選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列60-61
• 2.4.1 基因組DNA的生物素標(biāo)記和超聲波處理60
• 2.4.2 樣品雜交60-61
• 2.4.3 轉(zhuǎn)錄序列的捕獲61
• 2.5 SCOTS克隆的PCR鑒定和測序61-62
• 2.6 Real-time RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因62
• 3 結(jié)果62-65
• 3.1 細(xì)菌基因組DNA的定量62
• 3.2 空腸彎曲菌rDNA的克隆與重組質(zhì)粒的鑒定62
• 3.3 生物素標(biāo)記的11168菌株基因組及rDNA重組質(zhì)粒的破碎62-63
• 3.4 RNA的測定63-64
• 3.5 SCOTS結(jié)果64
• 3.6 感染相關(guān)基因的功能注釋64
• 3.7 篩選基因的Real-time RT-PCR驗(yàn)證64-65
• 4 討論65-67
• 參考文獻(xiàn)67-69
• 附錄69-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文目錄71-72
• 致謝72-73

【參考文獻(xiàn)】

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