本文關(guān)鍵詞：卵巢癌順鉑耐藥裸鼠模型的構(gòu)建及差異因子篩選

  更多相關(guān)文章： 卵巢上皮癌 鉑類耐藥 動物模型 表達譜芯片 定量蛋白質(zhì)組學(xué) TGCA

【摘要】：目的建立一種鉑類耐藥性穩(wěn)定人卵巢上皮癌(EOC)的裸鼠移植瘤模型,分析其抵抗順鉑的生物學(xué)特性及其分子機制,并在基因水平和蛋白水平上動態(tài)的研究卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)分子,為研究體內(nèi)微環(huán)境耐藥機制及逆轉(zhuǎn)靶點基因篩選奠定基礎(chǔ)。 方法GFP標(biāo)記的EOC細胞株SKOV3-GFP在體外培養(yǎng)或在裸鼠皮下注射,經(jīng)DDP誘導(dǎo)后建成SKOV3/DDP i和SKOV3/DDP ii,將這兩株細胞再種植于裸鼠皮下經(jīng)再次的DDP誘導(dǎo)分別建成兩株順鉑(DDP)耐藥的EOC細胞株SKOV3/DDP Ⅰ和SKOV3/DDPⅡ,檢測它們的DDP半數(shù)抑制濃度(IC50值),動態(tài)分析用藥濃度與細胞周期、凋亡和胞內(nèi)藥物濃度關(guān)系。體內(nèi)動態(tài)觀察移植瘤細胞亞結(jié)構(gòu)改變和耐藥相關(guān)基因PTEN. STAT5、XIAP、BRCA1和MDR1基因表達。應(yīng)用Ⅲumina表達譜芯片和Itraq標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)動態(tài)分析多次順鉑處理后的差異表達基因和蛋白,采用GO對差異基因和蛋白進行分類,應(yīng)用DAVID軟件在線富集相關(guān)信號通路。將找出的共同差異基因／蛋白與癌癥基因圖譜(TGCA)所提供卵巢癌敏感和耐藥患者的信息進行臨床預(yù)后分析,QRT-PCR對顯著差異的A2M、CRABP2、ITIH3、MYLK、 EFEMP1、LNPEP和CTTNBP2NL基因進行驗證。將TGCA提供的卵巢癌患者基因表達譜數(shù)據(jù)分為A2M、ITIH3和CTTNBP2NL基因高和低表達兩組,分別比較兩組間的差異基因,進行信號通路富集。 結(jié)果MTT法和流式細胞術(shù)測得SKOV3/DDPⅡ耐藥指數(shù)分別為2.8和3.8, SKOV3/DDP I耐藥指數(shù)為2.2和3.4；29.7μ moL/L和39.6u moL/L DDP處理36h的SKOV3/DDP I和SKOV3/DDP Ⅱ凋亡率顯著低于SKOV3-GFP (P1=0.024, P2=0.001); SKOV3/DDPⅡ和SKOV3/DDP Ⅰ細胞內(nèi)DDP濃度始終顯著低于SKOV3-GFP細胞。DDP作用于體內(nèi)移植瘤5次后,大部份SKOV3-GFP細胞器降解,細胞核膜不完整,但SKOV3/DDPⅡ細胞在8次用藥后才出現(xiàn)細胞器降解；體內(nèi)SKOV3/DDPⅡ細胞的STAT5和BRCA1基因表達隨用藥次數(shù)遞增而增大,XIAP和與DDP用藥次數(shù)呈正相關(guān)(R=0.964)。DDP作用體內(nèi)移植瘤8次后,STAT5, XIAP和BRCA1在SKOV3/DDPⅡ的相對表達分別顯著高于對應(yīng)處理的SKOV3-GFP細胞3.86倍,28.1倍和14.6倍,PTEN則降低3.77倍。利用表達譜芯片找出535個差異表達的基因,其中有239個上調(diào)表達,296個下調(diào)表達,定量蛋白質(zhì)組學(xué)共找出上調(diào)差異蛋白的573個,下調(diào)458個。通過DAVID軟件的GO模塊對基因進行功能注釋并對基因進行功能聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些差異表達的基因主要參與胞內(nèi)受體介導(dǎo)的信號、免疫應(yīng)答、激素應(yīng)激反應(yīng)、細胞周期、轉(zhuǎn)錄及拼接、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和凋亡等生物學(xué)過程。用DAVID軟件的KEGG Table and Map功能模塊進行分析發(fā)現(xiàn),表達譜芯片和質(zhì)譜上調(diào)的差異基因主要參與DNA的復(fù)制、非同源末端修復(fù)、氧化磷酸化和氨基酸、核苷酸的代謝和Ⅱ型糖尿病形成,下調(diào)基因主要參與肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、補體系統(tǒng)、抗原加工與提呈、氨基酸代謝和Nod樣受體信號通路等。ITIH3、MYLK、A2M、CRABP2、EFEMP、LNPEP和CTTNBP2NL基因的QRT-PCR驗證結(jié)果與篩選結(jié)果一致。分析TCGA提供的卵巢癌患者臨床信息發(fā)現(xiàn),A2M在耐藥患者中表達顯著降低,CTTNBP2NL與患者無進展生存時間和無鉑類治療間隔負相關(guān),高和低表達A2M與LNPEP基因兩組患者的生存曲線存在明顯差異。A2M基因組的上調(diào)基因主要參與免疫應(yīng)答相關(guān)信號通路,包括NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性通路、B細胞受體信號通路和T細胞受體信號通路,TOLL樣受體信號通路,NOD樣受體信號通路以及腫瘤形成通路等,而下調(diào)基因主要參與各種代謝及錯配修復(fù)等通路；LNPEP基因組上調(diào)基因主要參與細胞外基質(zhì)受體相互作用、細胞粘附分子、腫瘤形成、凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Wnt信號、P53信號、Fc受體介導(dǎo)的吞噬、泛素介導(dǎo)的蛋白降解、TOll樣受體等信號通路,而下調(diào)基因主要參與鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、腫瘤形成、平滑肌收縮、GnRH通路和視黃醇代謝等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；CTTNBP2NL基因組中上調(diào)基因參的信號通路主要有細胞外基質(zhì)受體相互作用、細胞粘附分子、腫瘤形成、凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性、泛素介導(dǎo)的蛋白降解、TGF-β信號、Wnt信號、P53信號、Toll樣受體和NOD樣受體等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,而下調(diào)表達基因參與的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、平滑肌收縮、細胞內(nèi)吞、GnRH通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)論建立卵巢癌鉑類耐藥體內(nèi)模型,所獲耐藥細胞SKOV3/DDPⅡ具有穩(wěn)定的耐DDP指數(shù)。卵巢癌對鉑類的獲得性耐藥是一個多步驟進行、多基因參與、多條信號通路同時進行調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程。找出耐藥細胞中下調(diào)的A2M、CRABP2、ITIH3和MYLK基因,以及上調(diào)的EFEMP1、 LNPEP和CTTNBP2NL基因,可能是通過對多條通路進行調(diào)控的關(guān)鍵分子,這給卵巢癌臨床耐藥逆轉(zhuǎn)治療提供了一個很好的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：卵巢上皮癌 鉑類耐藥 動物模型 表達譜芯片 定量蛋白質(zhì)組學(xué) TGCA
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R737.31
【目錄】：

• 主要英文~.寫5-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-16
• 第一章 卵巢癌鉑類耐藥研究進展(文獻綜述)16-37
• 1、卵巢癌化療現(xiàn)狀16-21
• 2、鉑類藥物抗腫瘤機理21-25
• 3、已知的鉑類耐藥機制25-34
• 4、鉑類耐藥研究的困難及問題34-35
• 5、本文研究的目的和意義35-37
• 第二章 卵巢癌順鉑耐藥裸鼠模型的構(gòu)建37-102
• 1 材料與方法37-58
• 1.1 細胞和動物來源37-38
• 1.2 試劑和儀器38-39
• 1.3 細胞培養(yǎng)39-41
• 1.4 誘導(dǎo)耐藥方法41-43
• 1.5 體內(nèi)腫瘤生長檢測43-44
• 1.6 IC50、耐藥指數(shù)測定44-46
• 1.7 流式細胞儀對不同濃度的DDP作用后細胞凋亡的檢測46-47
• 1.8 流式細胞儀檢測細胞周期47-49
• 1.9 高效液相色譜(HPLC)檢測細胞內(nèi)順鉑49-51
• 1.10 透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)51-52
• 1.11 實時勞光定量PCR (QRT-PCR)檢測裸鼠模型瘤塊中耐藥相關(guān)基因的表達52-58
• 2 結(jié)果58-96
• 2.1 卵巢癌鉑類耐藥裸鼠模型成功建立58-63
• 2.2 細胞的耐藥指數(shù)測定63
• 2.3 細胞凋亡分析63-68
• 2.4 半抑制濃度DDP作用后細胞周期變化分析68-73
• 2.5 細胞周期變化與凋亡的相關(guān)性分析73-75
• 2.6 高效液相色譜檢測體外培養(yǎng)細胞內(nèi)DDP濃度的結(jié)果75-85
• 2.7 電鏡觀察不同DDP注射次數(shù)細胞超微結(jié)構(gòu)的變化85-89
• 2.8 QRT-PCR驗證裸鼠模型耐藥相關(guān)基因的表達89-96
• 3 討論96-102
• 第三章 表達譜芯片和定量蛋白質(zhì)組技術(shù)動態(tài)分析卵巢癌抵抗順鉑相關(guān)分子102-164
• 1 材料與方法103-120
• 1.1 腫瘤組織來源104
• 1.2 儀器和試劑104-106
• 1.3 基因芯片實驗流程106-113
• 1.4 表達譜芯片數(shù)據(jù)分析流程113-114
• 1.5 定量蛋白組試驗操作步驟114-116
• 1.6 數(shù)據(jù)處理方法116-117
• 1.7 TCGA數(shù)據(jù)來源117
• 1.8 表達譜芯片和質(zhì)譜找出的共同差異的基因/蛋白與TCGA數(shù)據(jù)進行臨床預(yù)后分析117-118
• 1.9 QRT-PCR對篩選出來的差異基因進行驗證118-120
• 1.10 差異表達基因所調(diào)控的信號通路120
• 2 結(jié)果120-157
• 2.1 mRNA表達譜的結(jié)果121-123
• 2.2 質(zhì)譜結(jié)果分析123
• 2.3 mRNA芯片結(jié)果關(guān)聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果分析耐藥相關(guān)差異蛋白123-132
• 2.4 耐藥相關(guān)信號通路的生物信息學(xué)分析132-138
• 2.5 順鉑耐藥差異蛋白與臨床預(yù)后分析138-142
• 2.6 篩選出的基因進行熒光定量PCR(QRT-PCR)驗證142-146
• 2.7 分析篩選出的差異表達基因所調(diào)控的信號通路146-157
• 3 討論157-164
• 第四章 全文小結(jié)164-167
• 1 技術(shù)路線總結(jié)164-166
• 2 結(jié)果總結(jié)166-167
• 參考文獻167-184
• 致謝184-185

【參考文獻】

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本文編號：828502