本文關(guān)鍵詞：基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的適體傳感器用于檢測(cè)藥物小分子—腺苷

  更多相關(guān)文章： 適體傳感器 發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝 無酶擴(kuò)增技術(shù) 腺苷

【摘要】：生物傳感器是一種能將生物識(shí)別過程轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)信號(hào)的裝置,主要包括兩個(gè)重要的功能性組件：目標(biāo)物識(shí)別組件和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件。其中,目標(biāo)物識(shí)別組件是影響其傳感性能的核心元素。近年來,適體以其高親和力、高特異性以及廣泛目標(biāo)物等特點(diǎn)引起了人們?cè)絹碓蕉嗟难芯颗d趣和關(guān)注。以適體為識(shí)別元件的傳感器即適體傳感器逐漸成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)和研究重點(diǎn)。由于靈敏度高、響應(yīng)快速和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì),熒光法已作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件廣泛用于各類適體傳感器中。因此,本文的研究工作主要集中于如何在現(xiàn)有生物學(xué)分析技術(shù)基礎(chǔ)上構(gòu)建新型的熒光適體傳感器。 腺苷是一種重要的生物藥物小分子,參與機(jī)體多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié),具有重要的生理和藥理作用,如舒張血管、收縮平滑肌以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用,是治療陣上性心動(dòng)過速(PSVT)的一線藥物。此外,生物樣本中腺苷的檢測(cè)可用于疾病診斷、病程的監(jiān)測(cè)以及癌癥的早期診斷。因此對(duì)腺苷的定量檢測(cè),尤其是生物樣本中腺苷的檢測(cè)在臨床研究、疾病的診斷和預(yù)防以及癌癥的早期診斷等方面具有重要的意義。 自腺苷適體被篩選出來后,基于適體傳感器的腺苷檢測(cè)法得以快速發(fā)展。然而,現(xiàn)有的腺苷適體傳感系統(tǒng)靈敏度往往不夠理想,且不能直接用于復(fù)雜生物樣本中腺苷的定量檢測(cè)。因此,進(jìn)一步提高腺苷檢測(cè)的靈敏度和實(shí)現(xiàn)生物樣本中的直接檢測(cè)是現(xiàn)在腺苷適體傳感器所面臨的重大挑戰(zhàn)。本文中我們利用恒溫、無酶的信號(hào)放大技術(shù)——發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝,構(gòu)建了新型的熒光適體傳感器,提高了腺苷的檢測(cè)靈敏度,實(shí)現(xiàn)了生物樣本中腺苷的分析檢測(cè)。 第一章首先對(duì)生物傳感器進(jìn)行了綜述,尤其是熒光適體傳感器的特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)及發(fā)展。其次,概述了現(xiàn)有的幾類等溫信號(hào)放大技術(shù),重點(diǎn)介紹了基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的無酶信號(hào)放大技術(shù)。隨后,對(duì)腺苷的重要生理和藥理作用進(jìn)行了介紹。最后,就腺苷適體傳感器的發(fā)展和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了概述。 第二章構(gòu)建了基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的新型適體傳感系統(tǒng),成功實(shí)現(xiàn)了腺苷的無酶、免標(biāo)記和雙重放大的分析檢測(cè)。通過設(shè)計(jì)將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)引物鏈部分封閉在發(fā)卡H2中,將G-四分體序列分別連接在發(fā)卡H3的兩端。腺苷的加入可以觸發(fā)發(fā)卡H1和H2進(jìn)行催化自組裝反應(yīng)(CHA),實(shí)現(xiàn)信號(hào)的第一步放大；CHA產(chǎn)物所暴露出的HCR引物鏈可以進(jìn)一步觸發(fā)H3和H4進(jìn)行HCR擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)信號(hào)的第二步放大。HCR反應(yīng)后,原來分為兩段的G-四分體序列可以形成完整的G-四分體結(jié)構(gòu),插入熒光染料NMM后實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,該方法對(duì)腺苷的線性范圍為5.0×10-6mOl L-1-2.O×10-4mOl L-1,檢測(cè)限為9.7×10-7mol L-1。該檢測(cè)限較Yu課題組酶輔助放大的腺苷適體傳感器降低了約12倍,較本課題組之前構(gòu)建的無酶、放大的腺苷適體傳感器降低了約6倍。所構(gòu)建的適體傳感器能實(shí)現(xiàn)均相中腺苷的無酶、免標(biāo)記和雙重放大的定量檢測(cè),靈敏度高、特異性好,具有在復(fù)雜生物基質(zhì)中應(yīng)用的潛能。 雖然我們構(gòu)建的腺昔適體傳感器的靈敏度得到了顯著提高,但是該靈敏度仍舊不夠理想,不能用于生物樣本的直接分析檢測(cè)。為此,我們開展了下一個(gè)工作。第三章構(gòu)建了基于共區(qū)域化觸發(fā)HCR的腺苷適體傳感器,可以用于生物樣本中腺苷的直接檢測(cè)。在該體系中,首先將腺苷適體截為兩半,分別連有粘性末端區(qū)域和鏈置換區(qū)域,通過腺苷的“粘合”作用使得兩個(gè)適體片段結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)粘性末端區(qū)域和鏈置換區(qū)域的共區(qū)域化,形成完整的引物鏈,觸發(fā)HCR反應(yīng)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,該方法對(duì)腺苷的線性范圍為1.0×10-6mol L-1.2×10-4mOlL-1,檢測(cè)限為2.0×10-7mol L-1,較Yu課題組酶輔助放大的腺苷適體傳感器降低了60倍,較本課題組之前構(gòu)建的無酶放大的腺苷適體傳感器降低了約30倍。該方法無酶、免標(biāo)記、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、背景低,且能實(shí)現(xiàn)生物樣本中腺苷的直接檢測(cè)。此外,通過簡(jiǎn)單改變適體部分,該平臺(tái)可用于其它目標(biāo)物的分析檢測(cè),具有較高的通用性。
【關(guān)鍵詞】：適體傳感器 發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝 無酶擴(kuò)增技術(shù) 腺苷
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 符號(hào)說明14-15
• 第一章 緒論15-35
• 1.1 引言15
• 1.2 熒光適體傳感器15-20
• 1.2.1 識(shí)別組件——適體15-16
• 1.2.2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件——熒光16-18
• 1.2.3 熒光適體傳感器的發(fā)展18-20
• 1.3 信號(hào)放大技術(shù)20-31
• 1.3.1 基于蛋白酶催化的信號(hào)放大策略20-26
• 1.3.2 基于脫氧核酶的信號(hào)放大策略26-29
• 1.3.3 無酶的信號(hào)放大策略29-31
• 1.4 腺苷31-34
• 1.4.1 腺苷的檢測(cè)意義31-32
• 1.4.2 腺苷主要的檢測(cè)方法32-33
• 1.4.3 腺苷適體傳感器面臨的問題33-34
• 1.5 本論文擬開展的工作34-35
• 第二章 基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的新型腺苷適體傳感器35-55
• 2.1 引言35-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分36-38
• 2.2.1 儀器裝置36
• 2.2.2 試劑36-37
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法37-38
• 2.2.4 凝膠的制備和電泳實(shí)驗(yàn)38
• 2.3 結(jié)果與討論38-54
• 2.3.1 適體傳感器的工作原理38-39
• 2.3.2 發(fā)卡探針的設(shè)計(jì)39
• 2.3.3 四分體結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)39-41
• 2.3.4 阻滯鏈的設(shè)計(jì)41-42
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)42-43
• 2.3.6 體系的熒光圖譜43-44
• 2.3.7 反應(yīng)條件的優(yōu)化44-50
• 2.3.7.1 適體催化鏈濃度的優(yōu)化44-45
• 2.3.7.2 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的濃度和比例的優(yōu)化45-48
• 2.3.7.3 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化48-49
• 2.3.7.4 NMM的用量?jī)?yōu)化49-50
• 2.3.8 腺苷的分析檢測(cè)50-52
• 2.3.9 建立適體傳感器的方法學(xué)驗(yàn)證52-54
• 2.4 結(jié)論54-55
• 第三章 基于共區(qū)域化觸發(fā)的HCR的腺苷適體傳感器55-75
• 3.1 引言55-57
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分57-58
• 3.2.1 儀器裝置57
• 3.2.2 試劑57-58
• 3.3 實(shí)驗(yàn)步驟58-60
• 3.3.1 磁球的活化58
• 3.3.2 生物素化DNA的固定58-59
• 3.3.3 腺苷誘導(dǎo)的共區(qū)域化59
• 3.3.4 HCR反應(yīng)59
• 3.3.5 插入SYBR Green I和熒光檢測(cè)59-60
• 3.4 結(jié)果與討論60-74
• 3.4.1 腺苷誘導(dǎo)共區(qū)域化的適體傳感器的工作原理60-61
• 3.4.2 適體傳感器的設(shè)計(jì)61
• 3.4.3 配對(duì)堿基個(gè)數(shù)的優(yōu)化61-62
• 3.4.4 聚丙烯酰胺凝膠的配置與電泳實(shí)驗(yàn)62-63
• 3.4.5 熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證63
• 3.4.6 系統(tǒng)條件優(yōu)化63-67
• 3.4.7 腺苷的分析檢測(cè)67-68
• 3.4.8 建立適體傳感器的方法學(xué)驗(yàn)證68-70
• 3.4.9 生物樣本中的分析應(yīng)用70-74
• 3.4.9.1 尿樣中腺苷的校準(zhǔn)曲線70-72
• 3.4.9.2 尿樣中腺苷分析檢測(cè)的方法學(xué)驗(yàn)證72-73
• 3.4.9.3 尿樣中腺苷的檢測(cè)73-74
• 3.5 結(jié)論74-75
• 參考文獻(xiàn)75-90
• 致謝90-91
• 碩士期間發(fā)表論文91-92
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表92

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 陳秀英,彭孝軍;DNA分子熒光探針[J];染料與染色;2004年06期

2 呂武清,顏華榮,龍新華;薄層掃描法測(cè)定金水寶膠囊中腺苷的含量[J];中草藥;1996年01期

3 朱文玲;腺苷在心血管病診治中的應(yīng)用前景[J];中華心血管病雜志;2004年10期

4 王文昭;趙欣捷;李響;陳靜;李方樓;許國(guó)旺;;尿中修飾核苷代謝輪廓分析在肺癌診斷中的作用[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2007年06期

5 滕紅;;腺苷在心血管疾病中的應(yīng)用[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2011年24期

，

本文編號(hào)：789536