本文關(guān)鍵詞：miR-21-4T1細(xì)胞的構(gòu)建及其exosome功能的初步研究

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【摘要】：目的：microRNA-21（miR-21）是一種在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)的microRNA，包括乳腺癌，它參與并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。細(xì)胞中的microRNA可以分泌到exosome中去。Exosome是一種細(xì)胞分泌的膜性納米小泡。腫瘤分泌的exosome可以通過(guò)自分泌方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)旁分泌或者是內(nèi)分泌方式抑制免疫監(jiān)視、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為其生長(zhǎng)和進(jìn)展提供一個(gè)有利的環(huán)境。為了進(jìn)一步探討miR-21是否會(huì)通過(guò)釋放的exosome影響腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了高表達(dá)miR-21的4T1細(xì)胞株，初步探究其分泌的exosome對(duì)腫瘤細(xì)胞以及免疫細(xì)胞的影響。 方法： 1構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)miR-21的4T1細(xì)胞株 利用慢病毒載體構(gòu)建高表達(dá)miR-21的4T1細(xì)胞株即miR-21-4T1細(xì)胞株，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證該穩(wěn)轉(zhuǎn)株中miR-21的過(guò)表達(dá)，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-21-4T1細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)情況。同時(shí)構(gòu)建空載體對(duì)照scramble-4T1細(xì)胞。 2miR-21對(duì)4T1生物性狀的影響 通過(guò)細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)（MTS方法）、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分別觀察miR-21升高后對(duì)4T1細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。 3exosome的制備 收集72小時(shí)體外培養(yǎng)miR-21-4T1細(xì)胞的上清，差速離心法分離提取exosome：300×g，10分鐘；2000×g，20分鐘；10000×g，30分鐘；然后將上清超高速100000×g離心120分鐘。最后用磷鎢酸負(fù)染exosome并在透射電子顯微鏡下觀察exosome的形態(tài)。 4miR-21-4T1細(xì)胞分泌的exosome功能研究 實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)來(lái)自miR-21-4T1細(xì)胞的exosome中miR-21的相對(duì)表達(dá)情況。MTS實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分別觀察miR-21-4T1所分泌的exosome對(duì)4T1細(xì)胞增殖、遷移能力的影響；采用ELISA試劑盒分析其對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠骨髓來(lái)源的DC細(xì)胞分泌IL-6、IL-10的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)小鼠骨髓來(lái)源的DC細(xì)胞表面分子MHCⅡ、CD86、CD54表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，利用慢病毒載體構(gòu)建的miR-21-4T1細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平升高了2.79±0.5411倍。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)miR-21-4T1、scramble-4T1細(xì)胞中幾乎均帶有綠色熒光，同樣流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的miR-21-4T1、scramble-4T1細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)率分別能夠達(dá)到93.58%±0.456、77.06%±0.844。 2MTS結(jié)果顯示miR-21-4T1細(xì)胞與4T1細(xì)胞增殖能力沒(méi)有顯著性差異，但在劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，miR-21-4T1細(xì)胞遷移能力要高于4T1和scramble-4T1細(xì)胞。 3利用差速離心方法得到的miR-21-4T1細(xì)胞分泌的exosome，通過(guò)磷鎢酸負(fù)染在透射電子顯微鏡下觀察到直徑約在40-100nm的橢圓形顆粒，中間淡染，邊緣深染。 4經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，miR-21-4T1細(xì)胞分泌的exosome中miR-21表達(dá)水平增加了3.49±0.2703倍。 5在增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)中，miR-21-4T1分泌的exosome與對(duì)照組沒(méi)有明顯的差異。但在Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，它所分泌的exosome能夠促進(jìn)4T1細(xì)胞遷移。 6miR-21-4T1分泌的exosome可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-10，但是該功能弱于4T1細(xì)胞的exosome，且這種作用不受TLR7受體阻斷劑所影響。 7miR-21-4T1來(lái)源的exosome可以促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-6、IL-10，，減少小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞表面的MHC II分子表達(dá)。 結(jié)論： 1過(guò)表達(dá)的miR-21可以促進(jìn)4T1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。 24T1細(xì)胞中的miR-21表達(dá)升高后，它所分泌的exosome中miR-21水平也會(huì)升高。 3過(guò)表達(dá)miR-21的exosome并沒(méi)有促進(jìn)4T1細(xì)胞增殖，但是可以促進(jìn)它的轉(zhuǎn)移能力。 4腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exosome對(duì)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞能夠起到免疫抑制的作用，但是miR-21升高后并沒(méi)有明顯促進(jìn)這種抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：exosome 4T1細(xì)胞株 microRNA-21 免疫抑制 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10
• 材料與方法10-21
• 結(jié)果21-23
• 附圖23-32
• 討論32-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 綜述 腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的新途徑—exosome37-53
• 參考文獻(xiàn)44-53
• 致謝53-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷54

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