發(fā)布時間：2017-08-30 07:38

  本文關鍵詞：重組人巨細胞病毒外被蛋白基因的表達

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【摘要】：人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)是一種以業(yè)臨床性感染或潛伏性感染為主要感染方式的病毒。HCMV能嚴重危害孕婦和胎兒以及免疫力低下的個體,并且在世界范圍內其感染性普遍存在�？笻CMV藥物可針對相關性疾病起到階段性改善作用,但存在毒副作用和耐藥性等缺陷,使得抗HCMV疫苗的研發(fā)更具有意義。評價抗HCMV疫苗的理想程度是根據其所包含的具有免疫作用的抗原成分。理想的抗原成分可誘導廣譜的中和抗體反應和細胞毒性T淋巴細胞反應,對初次感染的預防有顯著作用,且對HCMV感染率與發(fā)病率有很好的控制效果,并解決了安全性與耐受性的問題。HCMV是一種胞內感染病毒,只有通過細胞免疫才能將其完全清除。常規(guī)的預防性疫苗主要是針對未感染的個體,誘導其有效的免疫應答,對已感染的個體不起作用。因此,研發(fā)可清除病原體與感染細胞的治療性疫苗具有更深遠的意義。外被磷蛋白65(Phosphoprotein65, pp65)和包膜糖蛋白B(Glycoprotein B, gB)在介導HCMV感染和病毒復制過程中發(fā)揮重要的作用,pp65是誘導機體產生細胞免疫的主要抗原,而gB是誘導機體產生體液免疫的主要抗原。 本研究將pp65與gB抗原表位基因通過重疊延伸PCR融合,獲得融合基因pp65362-504-gB607-621,構建重組表達載體pFLAG-ATS-pp65362-504-gB607-621并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達,通過誘導條件的改變未獲得可溶性融合蛋白。為了實現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達,利用Bac-to-Bac系統(tǒng)進行目的蛋白的表達。本研究構建了一個同時編碼報告基因增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因和帶有6個組氨酸標簽片段的融合基因的載體pFastBacTMual-EGFP-pp65362-504-gB607-621,兩個基因片段分別控制于p10和PH啟動子,雙酶切反應和測序驗證重組質粒構建正確。將重組質粒轉化E. coil DH1OBac發(fā)生定點轉座產生重組桿粒bacmid-EGFP-pp65362-504-gB607-621,PCR驗證其構建正確。采用脂質體轉染試劑將重組桿粒轉入昆蟲細胞系Sf9中,擴增獲得的桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞表達融合蛋白。通過SDS-PAGE和Western Blot對融合蛋白的表達進行檢測。結果證明融合蛋白在昆蟲細胞可溶性表達并能夠與抗體發(fā)生特異的反應。
【關鍵詞】：人巨細胞病毒 外被磷蛋白65 包膜糖蛋白B 可溶性表達
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 文獻綜述11-22
• 1.1 人巨細胞病毒(HCMV)11-14
• 1.1.1 HCMV生物學特征11-12
• 1.1.2 HCMV流行病學12-13
• 1.1.3 HCMV致病機制13
• 1.1.4 HCMV所致疾病13-14
• 1.2 人體抗HCMV感染機制14-17
• 1.2.1 機體針對HCMV的體液免疫14-16
• 1.2.2 機體針對HCMV的細胞免疫16-17
• 1.3 HCMV的防治17-20
• 1.3.1 抗HCMV藥物17
• 1.3.2 HCMV疫苗17-18
• 1.3.3 gB在HCMV疫苗中的研究18-20
• 1.3.4 pp65在HCMV疫苗中的研究20
• 1.4 本課題的研究思路及主要研究內容20-22
• 2 重組HCMV外被蛋白基因在大腸桿菌中的表達22-35
• 2.1 引言22
• 2.2 實驗材料、試劑和儀器22-24
• 2.2.1 實驗儀器22-23
• 2.2.2 實驗試劑23-24
• 2.3 實驗方法24-31
• 2.3.1 HCMVpp65_(362-504)-gB_(607-621)基因的獲得24-26
• 2.3.2 pFLAG-ATS-pp65_(362-504)-gB_(607-621)載體的構建26-29
• 2.3.3 重組質粒的誘導表達29-30
• 2.3.4 SDS-PAGE檢測HCMV外被融合蛋白表達30-31
• 2.4 實驗結果與討論31-33
• 2.4.1 PCR擴增HCMV目的基因片段31-32
• 2.4.2 pFLAG-ATS-pp65_(362-504)-gB_(607-621)重組質粒的構建與鑒定32
• 2.4.3 重組HCMV外被蛋白在大腸桿菌中的表達32-33
• 2.5 討論33-34
• 2.6 小結34-35
• 3 重組HCMV外被蛋白基因在昆蟲細胞中的表達35-54
• 3.1 引言35
• 3.2 實驗材料35-37
• 3.2.1 實驗儀器35-36
• 3.2.2 實驗試劑36-37
• 3.3 實驗方法37-45
• 3.3.1 HCMVpp65_(362-504)-gB_(607-621)基因的獲得37-38
• 3.3.2 pFastBac~(TM)Dual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)載體的構建38-41
• 3.3.3 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的構建41-42
• 3.3.4 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的轉染42-43
• 3.3.5 重組HCMV外被蛋白基因在昆蟲細胞中的表達43
• 3.3.6 SDS-PAGE檢測表達蛋白質43
• 3.3.7 Western Blot檢測昆蟲細胞表達目的蛋白質43-44
• 3.3.8 昆蟲細胞表達目的蛋白質的純化44-45
• 3.3.9 昆蟲細胞表達目的蛋白質加入病毒量的優(yōu)化45
• 3.4 實驗結果45-51
• 3.4.1 HCMV pp65_(362-504)-gB_(607-621)融合基因PCR擴增45-47
• 3.4.2 pFastBacTMDual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)載體的構建與鑒定47
• 3.4.3 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的構建47-48
• 3.4.4 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的轉染48
• 3.4.5 重組HCMV外被蛋白基因在昆蟲細胞中的表達48-49
• 3.4.6 Western Blot檢測目的蛋白質49-50
• 3.4.7 昆蟲細胞表達目的蛋白質的純化50-51
• 3.4.8 昆蟲細胞表達目的蛋白質加入病毒量的優(yōu)化51
• 3.5 討論51-52
• 3.6 小結52-54
• 結論與展望54-55
• 結論54
• 展望54-55
• 參考文獻55-62
• 附錄A 縮略語表及名稱說明62-64
• 附錄B-Ⅰ pFLAG-ATS載體質粒64-65
• 附錄B-Ⅱ pFastBac~(TM)Dual載體質粒65-67
• 附錄C-Ⅰ pFLAG-ATS-pp65_(362.504)-gB_(607-621)測序結果67-69
• 附錄C-Ⅱ pFastBac~(TM)Dual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)測序結果69-71
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況71-72
• 致謝72-73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前3條

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本文編號：758057