本文關(guān)鍵詞：重組人巨細(xì)胞病毒外被蛋白基因的表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 人巨細(xì)胞病毒 外被磷蛋白65 包膜糖蛋白B 可溶性表達(dá)

【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)是一種以業(yè)臨床性感染或潛伏性感染為主要感染方式的病毒。HCMV能嚴(yán)重危害孕婦和胎兒以及免疫力低下的個(gè)體,并且在世界范圍內(nèi)其感染性普遍存在�？笻CMV藥物可針對(duì)相關(guān)性疾病起到階段性改善作用,但存在毒副作用和耐藥性等缺陷,使得抗HCMV疫苗的研發(fā)更具有意義。評(píng)價(jià)抗HCMV疫苗的理想程度是根據(jù)其所包含的具有免疫作用的抗原成分。理想的抗原成分可誘導(dǎo)廣譜的中和抗體反應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng),對(duì)初次感染的預(yù)防有顯著作用,且對(duì)HCMV感染率與發(fā)病率有很好的控制效果,并解決了安全性與耐受性的問題。HCMV是一種胞內(nèi)感染病毒,只有通過細(xì)胞免疫才能將其完全清除。常規(guī)的預(yù)防性疫苗主要是針對(duì)未感染的個(gè)體,誘導(dǎo)其有效的免疫應(yīng)答,對(duì)已感染的個(gè)體不起作用。因此,研發(fā)可清除病原體與感染細(xì)胞的治療性疫苗具有更深遠(yuǎn)的意義。外被磷蛋白65(Phosphoprotein65, pp65)和包膜糖蛋白B(Glycoprotein B, gB)在介導(dǎo)HCMV感染和病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要的作用,pp65是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫的主要抗原,而gB是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫的主要抗原。 本研究將pp65與gB抗原表位基因通過重疊延伸PCR融合,獲得融合基因pp65362-504-gB607-621,構(gòu)建重組表達(dá)載體pFLAG-ATS-pp65362-504-gB607-621并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),通過誘導(dǎo)條件的改變未獲得可溶性融合蛋白。為了實(shí)現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達(dá),利用Bac-to-Bac系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。本研究構(gòu)建了一個(gè)同時(shí)編碼報(bào)告基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因和帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽片段的融合基因的載體pFastBacTMual-EGFP-pp65362-504-gB607-621,兩個(gè)基因片段分別控制于p10和PH啟動(dòng)子,雙酶切反應(yīng)和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coil DH1OBac發(fā)生定點(diǎn)轉(zhuǎn)座產(chǎn)生重組桿粒bacmid-EGFP-pp65362-504-gB607-621,PCR驗(yàn)證其構(gòu)建正確。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組桿粒轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞系Sf9中,擴(kuò)增獲得的桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。通過SDS-PAGE和Western Blot對(duì)融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果證明融合蛋白在昆蟲細(xì)胞可溶性表達(dá)并能夠與抗體發(fā)生特異的反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：人巨細(xì)胞病毒 外被磷蛋白65 包膜糖蛋白B 可溶性表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-22
• 1.1 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)11-14
• 1.1.1 HCMV生物學(xué)特征11-12
• 1.1.2 HCMV流行病學(xué)12-13
• 1.1.3 HCMV致病機(jī)制13
• 1.1.4 HCMV所致疾病13-14
• 1.2 人體抗HCMV感染機(jī)制14-17
• 1.2.1 機(jī)體針對(duì)HCMV的體液免疫14-16
• 1.2.2 機(jī)體針對(duì)HCMV的細(xì)胞免疫16-17
• 1.3 HCMV的防治17-20
• 1.3.1 抗HCMV藥物17
• 1.3.2 HCMV疫苗17-18
• 1.3.3 gB在HCMV疫苗中的研究18-20
• 1.3.4 pp65在HCMV疫苗中的研究20
• 1.4 本課題的研究思路及主要研究內(nèi)容20-22
• 2 重組HCMV外被蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)22-35
• 2.1 引言22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器22-24
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-31
• 2.3.1 HCMVpp65_(362-504)-gB_(607-621)基因的獲得24-26
• 2.3.2 pFLAG-ATS-pp65_(362-504)-gB_(607-621)載體的構(gòu)建26-29
• 2.3.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)29-30
• 2.3.4 SDS-PAGE檢測(cè)HCMV外被融合蛋白表達(dá)30-31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論31-33
• 2.4.1 PCR擴(kuò)增HCMV目的基因片段31-32
• 2.4.2 pFLAG-ATS-pp65_(362-504)-gB_(607-621)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定32
• 2.4.3 重組HCMV外被蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)32-33
• 2.5 討論33-34
• 2.6 小結(jié)34-35
• 3 重組HCMV外被蛋白基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)35-54
• 3.1 引言35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料35-37
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器35-36
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑36-37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法37-45
• 3.3.1 HCMVpp65_(362-504)-gB_(607-621)基因的獲得37-38
• 3.3.2 pFastBac~(TM)Dual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)載體的構(gòu)建38-41
• 3.3.3 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的構(gòu)建41-42
• 3.3.4 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的轉(zhuǎn)染42-43
• 3.3.5 重組HCMV外被蛋白基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)43
• 3.3.6 SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)43
• 3.3.7 Western Blot檢測(cè)昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)43-44
• 3.3.8 昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)的純化44-45
• 3.3.9 昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)加入病毒量的優(yōu)化45
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-51
• 3.4.1 HCMV pp65_(362-504)-gB_(607-621)融合基因PCR擴(kuò)增45-47
• 3.4.2 pFastBacTMDual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)載體的構(gòu)建與鑒定47
• 3.4.3 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的構(gòu)建47-48
• 3.4.4 重組桿粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的轉(zhuǎn)染48
• 3.4.5 重組HCMV外被蛋白基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)48-49
• 3.4.6 Western Blot檢測(cè)目的蛋白質(zhì)49-50
• 3.4.7 昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)的純化50-51
• 3.4.8 昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)加入病毒量的優(yōu)化51
• 3.5 討論51-52
• 3.6 小結(jié)52-54
• 結(jié)論與展望54-55
• 結(jié)論54
• 展望54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 附錄A 縮略語表及名稱說明62-64
• 附錄B-Ⅰ pFLAG-ATS載體質(zhì)粒64-65
• 附錄B-Ⅱ pFastBac~(TM)Dual載體質(zhì)粒65-67
• 附錄C-Ⅰ pFLAG-ATS-pp65_(362.504)-gB_(607-621)測(cè)序結(jié)果67-69
• 附錄C-Ⅱ pFastBac~(TM)Dual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)測(cè)序結(jié)果69-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況71-72
• 致謝72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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3 王曉燕;彭慧琴;;人巨細(xì)胞病毒包膜糖蛋白gB、gH結(jié)構(gòu)、分型及生物學(xué)活性[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2008年10期

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本文編號(hào)：758057