發(fā)布時(shí)間：2017-08-30 07:20

  本文關(guān)鍵詞：mTOR特異性siRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：研究目的： 構(gòu)建并篩選可表達(dá)mTOR基因特異性siRNA的慢病毒，并在此基礎(chǔ)上采用巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子聯(lián)合重組酶表達(dá)基因構(gòu)建可在巨噬細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)siRNA的慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)體內(nèi)外研究其抗Mtb感染的效果及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1.根據(jù)mTOR基因的mRNA序列選擇3條靶序列，根據(jù)每條靶序列按siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的shRNA，同時(shí)根據(jù)其中一條shRNA序列設(shè)計(jì)一條長(zhǎng)度及堿基組成與之完全一致，但堿基順序被隨機(jī)打亂的序列作為對(duì)照shRNA序列。針對(duì)每條shRNA各設(shè)計(jì)一對(duì)單鏈寡聚脫氧核苷酸，經(jīng)緩慢退火后形成可表達(dá)相應(yīng)shRNA的雙鏈DNA，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶HpaⅠ和XhoⅠ克隆入慢病毒表達(dá)框架質(zhì)粒pSicoR中，獲取pSicoR-mTOR干擾質(zhì)粒并命名為pSM系列載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，篩選陽(yáng)性克隆、提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行DNA測(cè)序。 2.將重組慢病毒表達(dá)載體（pSM系列質(zhì)粒）、慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G按照一定比例混合共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集含有慢病毒顆粒的上清液，超濾離心，濃縮病毒顆粒。將慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞，利用逐孔稀釋法在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光表達(dá)情況，并計(jì)算病毒的滴度。采用適當(dāng)?shù)味鹊穆《绢w粒感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，48h后，觀(guān)察慢病毒顆粒感染RAW264.7細(xì)胞的情況。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)mTOR基因表達(dá)的變化。 3.利用PCR技術(shù)從質(zhì)粒Cre-Amp中擴(kuò)增出重組酶表達(dá)基因Cre，克隆至質(zhì)粒pBudCE4.1-SP146的Hind III/Xba I位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pBudCE4.1-SP146-Cre，酶切鑒定正確后送測(cè)序。 4.采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增獲取SP146-Cre片段、pSico的0至3808片段以及pSico的3783至7566片段，然后利用In-Fusion克隆技術(shù)將SP146-Cre克隆1國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：30901284）至pSico中。將重組載體pSico-SP146-Cre轉(zhuǎn)化大腸桿菌后選取陽(yáng)性克隆菌，采用菌落PCR方法進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定，鑒定成功后送測(cè)序驗(yàn)證。 5.將SP146啟動(dòng)子調(diào)控的質(zhì)粒pSico-SP146-Cre分別轉(zhuǎn)染293T、RAW264.7細(xì)胞，通過(guò)SP146啟動(dòng)子調(diào)控Cre/LoxP系統(tǒng)情況下，通過(guò)綠色熒光的表達(dá)模式觀(guān)察評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的特異性以及SP146調(diào)控下的Cre/LoxP系統(tǒng)的功能。 研究結(jié)果： 1.酶切及測(cè)序的結(jié)果顯示，mTor特異性siRNA表達(dá)序列及對(duì)照序列均正確插入到質(zhì)粒pSicoR中，成功構(gòu)建了mTOR基因特異性的siRNA慢病毒表達(dá)載體pSM1, pSM2, pSM3及對(duì)照siRNA表達(dá)載體pSM4。 2.利用293T細(xì)胞包裝重組慢病毒表達(dá)載體pSM1/2/3/4，生產(chǎn)出慢病毒顆粒后進(jìn)行病毒濃縮，經(jīng)病毒滴度測(cè)定，四組慢病毒lenti-pSM1/2/3/4的滴度分別是6×106TU/ml、1×106TU/ml、4×106TU/ml、2.5×106TU/ml。四種重組慢病毒顆粒感染RAW264.7細(xì)胞，48h后均可觀(guān)察到明亮的綠色熒光，表明重組慢病毒能有效感染RAW264.7細(xì)胞。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)的結(jié)果相一致，均證實(shí)了lenti-pSM1組、lenti-pSM2組、lenti-pSM3組的mTOR mRNA及蛋白表達(dá)均受到抑制，其mTOR mRNA表達(dá)水平的抑制率分別是24.1%、59.3%、41.1%，蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組（0.9567±0.021）及l(fā)enti-pSM4組（0.9200±0.030）相比三實(shí)驗(yàn)組的灰度值分別為：0.9033±0.025、0.883±0.031、0.893±0.032，其中l(wèi)enti-pSM2組為最佳干擾效果組。 4.菌落PCR及測(cè)序結(jié)果證實(shí)，MФ特異性啟動(dòng)子序列SP146及Cre基因片段已成功插入質(zhì)粒pSico中，，成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體pSico-SP146-Cre。將該重組載體及轉(zhuǎn)染入293T及RAW264.7細(xì)胞，觀(guān)察到其在293T細(xì)胞中有很強(qiáng)的綠色熒光，但是在RAW264.7細(xì)胞中幾乎沒(méi)有綠色熒光。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了針對(duì)mTOR基因干擾序列的系列慢病毒表達(dá)載體pSM。 2.完成了慢病毒的包裝和濃縮，成功地利用構(gòu)建的重組慢病毒載體生產(chǎn)的慢病毒顆粒感染了RAW264.7細(xì)胞，并篩選出mTOR shRNA2為最有效的干擾序列。 3.成功構(gòu)建了攜帶MФ特異性啟動(dòng)子序列SP146、重組酶Cre基因的慢病毒表達(dá)載體pSico-SP146-Cre。 4. SP146啟動(dòng)子具有良好的MФ特異性，可調(diào)控Cre/LoxP系統(tǒng)，為后續(xù)動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：mTOR siRNA 慢病毒表達(dá)載體
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R3416;R373
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 中英文縮略詞表11-13
• 第1章 引言13-17
• 第2章 mTOR 特異性 shRNA 表達(dá)慢病毒的構(gòu)建及篩選17-43
• 2.1 概述17-18
• 2.2 材料與方法18-31
• 2.2.1 材料18-23
• 2.2.2 方法23-31
• 2.3 結(jié)果31-39
• 2.3.1 重組慢病毒載體 pSM1/2/3/4 的構(gòu)建及其鑒定31-33
• 2.3.2 重組慢病毒包裝及病毒滴度的測(cè)定33-35
• 2.3.3 重組慢病毒感染 RAW264.7 細(xì)胞的熒光表達(dá)35-37
• 2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞中 mTOR 的表達(dá)37-38
• 2.3.5 Western blot 檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞中 mTOR 的表達(dá)38-39
• 2.4 討論39-43
• 第3章 巨噬細(xì)胞特異性慢病毒表達(dá)載體 pSico-SP146-Cre 的構(gòu)建與鑒定43-55
• 3.1 概述43
• 3.2 材料與方法43-50
• 3.2.1 材料43-45
• 3.2.2 方法45-50
• 3.3 結(jié)果50-53
• 3.3.1 質(zhì)粒 pBudCE4.1-SP146-Cre 的構(gòu)建及其鑒定50-51
• 3.3.2 慢病毒表達(dá)載體 pSico-SP146-Cre 的構(gòu)建及其鑒定51-52
• 3.3.3 慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后熒光的表達(dá)52-53
• 3.4 討論53-55
• 第4章 全文小結(jié)55-57
• 4.1 概述55
• 4.2 主要的研究結(jié)論55
• 4.3 本課題創(chuàng)新之處55-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果61-62
• 綜述62-69
• 參考文獻(xiàn)68-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 ;Lentivirual vector-mediated doxycycline-inducible iASPP gene targeted RNA interference in hepatocellular carcinoma[J];癌癥;2010年09期

2 劉悅;郝玉娥;詹軼群;許望翔;楊永升;葛常輝;;人甘油激酶慢病毒干涉載體的構(gòu)建和表達(dá)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年05期

3 朱煥章,史景泉,public.cta.cq.cn;Cre/LoxP系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因小鼠上的應(yīng)用策略[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2000年03期

本文編號(hào)：757959