發(fā)布時間：2017-08-30 08:09

  本文關(guān)鍵詞：RbAp48和PBDC1在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化中的功能研究

  更多相關(guān)文章： RbAp48 PBDC1 紅系分化 MEL細(xì)胞 丁酸鈉 多克隆抗體

【摘要】：細(xì)胞分化與去分化是生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點之一,對其機(jī)制的研究可以為腫瘤的發(fā)生及防治提供重要的依據(jù)。紅細(xì)胞分化是一個受到很多特定蛋白質(zhì)調(diào)控的十分精細(xì)的過程。在體外誘導(dǎo)劑的存在下,小鼠白血病MEL細(xì)胞可以向正常紅系分化方向分化,逐漸表達(dá)血紅蛋白,最后變成正�；蚪咏谡５募�(xì)胞。丁酸鈉是一種組蛋白去乙�；敢种苿�,它能夠通過抑制組蛋白去乙酰化酶活性,增強(qiáng)組蛋白的乙�；�,從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能夠抑制MEL細(xì)胞的增殖活力,誘導(dǎo)細(xì)胞向紅系方向分化,促使細(xì)胞表達(dá)血紅蛋白、血型糖蛋白A等紅系相關(guān)標(biāo)志蛋白。在丁酸鈉處理MEL細(xì)胞72h后,分化細(xì)胞的比例達(dá)到平臺期80%左右。此前,我們利用丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化作為紅系分化模型,發(fā)現(xiàn)RbAp48蛋白和PBDC1蛋白的表達(dá)量在MEL細(xì)胞分化過程中分別是上調(diào)和下調(diào),由此推測這兩個蛋白可能與紅系分化有關(guān)。 RbAp48是一個定位于細(xì)胞核的組蛋白結(jié)合蛋白,在小鼠各種組織中均有表達(dá)。在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化的過程中,RbAp48的表達(dá)水平逐漸上調(diào),且在丁酸鈉處理72h和96h后,其表達(dá)量達(dá)到分化前的1.5倍左右。同時,紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的表達(dá)水平在丁酸鈉處理72h之前也是逐漸上調(diào)的,而增殖相關(guān)蛋白c-Myc的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。GATA-1通過與基因啟動子中的(A/T)GATA(A/G)模序結(jié)合,從而激活造血特異基因。此外,c-Myc表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長速度以及分化程度相關(guān),在增殖速度較慢和分化程度較高的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低更為顯著。這表明RbAp48, GATA-1和c-Myc可能共同參與了紅系細(xì)胞分化。 免疫熒光實驗研究發(fā)現(xiàn)在分化早期RbAp48主要定位于細(xì)胞核,在丁酸鈉處理MEL細(xì)胞72h和96h后,較多的RbAp48存在于細(xì)胞質(zhì)中,且每個細(xì)胞RbAp48的平均熒光強(qiáng)度達(dá)到分化前的1.7倍左右。為進(jìn)一步研究RbAp48在MEL細(xì)胞分化中的作用,我們利用RNAi的方法構(gòu)建了低表達(dá)RbAp48的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株。聯(lián)苯胺染色結(jié)果表明,對照組的MEL細(xì)胞在丁酸鈉處理72h后分化比例達(dá)到83%,而低表達(dá)RbAp48的MEL細(xì)胞在丁酸鈉處理72h后分化比例只有63%,即分化能力下降了20%左右。這表明RbAp48的高表達(dá)對于MEL細(xì)胞分化是必需的。這些結(jié)果為RbAp48與MEL細(xì)胞分化之間的關(guān)系提出了新的認(rèn)識,對闡明紅系細(xì)胞終末分化的機(jī)制具有重要的理論意義。 由于PBDC1是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白,有關(guān)它的特性及功能尚不了解,而且還沒有商品化的PBDC1抗體。為了研究它在MEL細(xì)胞分化中的功能,本研究利用原核表達(dá)載體pET-28a(+)在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中大量表達(dá)PBDC1融合蛋白,通過鎳離子親和層析純化該蛋白,并以此免疫新西蘭大白兔制備抗血清,經(jīng)蛋白A柱純化后得到抗PBDC1蛋白的多克隆抗體。利用該抗體研究發(fā)現(xiàn)PBDC1在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化過程中逐漸下調(diào)。因此,本研究制備的PBDC1抗體為進(jìn)一步研究PBDC1在紅系分化中的功能提供了有利工具。此外,利用熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)PBDC1mRNA的表達(dá)水平在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL分化過程中也是逐漸下調(diào)。綜上所述,在MEL細(xì)胞分化過程中,我們發(fā)現(xiàn)PBDC1在基因水平和蛋白水平都是逐漸下調(diào)的,由此推測PBDC1可能是MEL細(xì)胞紅系分化的調(diào)控因子。PBDC1功能的相關(guān)研究工作還在繼續(xù)開展中。
【關(guān)鍵詞】：RbAp48 PBDC1 紅系分化 MEL細(xì)胞 丁酸鈉 多克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略表8-9
• 目錄9-12
• 第一章 緒論12-18
• 1 紅細(xì)胞分化12-13
• 2 RbAp48蛋白的研究現(xiàn)狀13-15
• 3 PBDC1蛋白簡介15
• 4 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)15-16
• 5 研究目的及意義16-17
• 6 技術(shù)路線和方法17-18
• 第二章 RbAp48在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化中的功能研究18-46
• 1 前言18
• 2 材料與方法18-34
• 2.1 材料18-22
• 2.1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒18
• 2.1.2 儀器18-19
• 2.1.3 試劑19-20
• 2.1.4 主要試劑的配制20-22
• 2.2 方法22-34
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 2.2.2 聯(lián)苯胺染色檢測丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞向紅系方向分化22
• 2.2.3 MTT比色法檢測丁酸鈉對MEL細(xì)胞活力的影響22
• 2.2.4 半定量PCR法檢測紅系相關(guān)基因在MEL細(xì)胞分化中的表達(dá)情況22-25
• 2.2.4.1 半定量PCR引物設(shè)計22-23
• 2.2.4.2 細(xì)胞總RNA的提取23
• 2.2.4.3 RNA的反轉(zhuǎn)錄23-24
• 2.2.4.4 半定量PCR檢測紅系相關(guān)基因的表達(dá)情況24-25
• 2.2.5 瑞氏染色25
• 2.2.6 Western blot檢測RbAp48在MEL細(xì)胞分化中的表達(dá)變化25-26
• 2.2.7 Western blot檢測GATA-1和c-Myc在MEL細(xì)胞分化中的表達(dá)變化26
• 2.2.8 Western blot檢測RbAp48在小鼠胎肝發(fā)育過程中的表達(dá)情況26
• 2.2.9 Western blot分析RbAp48的小鼠組織表達(dá)譜26
• 2.2.10 免疫熒光實驗檢測RbAp48在MEL細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞定位26-27
• 2.2.11 干擾載體pLKO.1-RbAp48-shRNA的構(gòu)建27-32
• 2.2.11.1 pLKO.1-TRC載體的實驗室應(yīng)用27-28
• 2.2.11.2 shRNA寡核苷酸序列的設(shè)計28
• 2.2.11.3 寡核苷酸片段的退火28
• 2.2.11.4 pLKO.1-TRC質(zhì)粒的小量提取28-29
• 2.2.11.5 pLKO.1-TRC質(zhì)粒的雙酶切29-30
• 2.2.11.6 pLKO.1-TRC與退火的寡核苷酸片段連接30
• 2.2.11.7 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備30
• 2.2.11.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞30-31
• 2.2.11.9 干擾載體pLKO.1-RbAp48-shRNA的雙酶切鑒定31
• 2.2.11.10 測序鑒定31-32
• 2.2.12 慢病毒的包裝32-33
• 2.2.12.1 質(zhì)粒的大抽32
• 2.2.12.2 病毒包裝32-33
• 2.2.13 低表達(dá)RbAp48的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株的建立33
• 2.2.14 Western blot檢證低表達(dá)RbAp48的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株33
• 2.2.15 低表達(dá)RbAp48對丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化能力的影響33-34
• 3 結(jié)果34-43
• 3.1 丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞向紅系方向分化34-36
• 3.1.1 聯(lián)苯胺染色檢測血紅蛋白的表達(dá)34
• 3.1.2 聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞的統(tǒng)計34-35
• 3.1.3 丁酸鈉抑制了MEL細(xì)胞生長活力35
• 3.1.4 α-globin,β-globin,and GPA mRNA在MEL細(xì)胞分化過程中逐漸上調(diào)35-36
• 3.2 瑞氏染色檢測表明MEL細(xì)胞分化后出現(xiàn)核固縮36
• 3.3 RbAp48在MEL細(xì)胞分化過程中逐漸上調(diào)36-37
• 3.4 c-Myc在MEL細(xì)胞分化過程中逐漸下調(diào),GATA-1在分化早期上調(diào)37
• 3.5 RbAp48在小鼠胎肝發(fā)育過程中逐漸上調(diào)37-38
• 3.6 RbAp48在小鼠不同組織中廣泛表達(dá)38
• 3.7 RbAp48在MEL分化過程中的亞細(xì)胞定位38-39
• 3.8 干擾載體pLKO.1-RbAp48-shRNA的鑒定39-40
• 3.8.1 干擾載體pLKO.1-RbAp48-shRNA的雙酶切鑒定39-40
• 3.8.2 干擾載體pLKO.1-RbAp48-shRNA的測序鑒定40
• 3.9 病毒包裝時轉(zhuǎn)染效率的檢測40-41
• 3.10 低表達(dá)RbAp48的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株的篩選41
• 3.11 Western blot鑒定低表達(dá)RbAp48的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株41-42
• 3.12 低表達(dá)RbAp48抑制了丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞的紅系分化能力42-43
• 4 討論43-46
• 第三章 PBDC1在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化中的功能研究46-63
• 1 前言46
• 2 材料與方法46-56
• 2.1 材料46-48
• 2.1.1 細(xì)胞株、菌株及質(zhì)粒46
• 2.1.2 儀器46-47
• 2.1.3 試劑47
• 2.1.4 主要試劑的配制47-48
• 2.2 方法48-56
• 2.2.1 重組pET-28a(+)-PBDC1質(zhì)粒的構(gòu)建48-51
• 2.2.1.1 pET-28a(+)載體的實驗室應(yīng)用48-49
• 2.2.1.2 MEL細(xì)胞中總RNA的提取49
• 2.2.1.3 RNA的反轉(zhuǎn)錄49
• 2.2.1.4 PBDC1基因的引物設(shè)計49-50
• 2.2.1.5 PBDC1基因的克隆50
• 2.2.1.6 pET-28(+)質(zhì)粒的提取50
• 2.2.1.7 PBDC1基因與pET-28a(+)質(zhì)粒連接50-51
• 2.2.1.8 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備51
• 2.2.1.9 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞51
• 2.2.2 重組pET-28a(+)-PBDC1質(zhì)粒的鑒定51-53
• 2.2.2.1 重組pET-28a(+)-PBDC1質(zhì)粒的PCR鑒定51-52
• 2.2.2.2 重組pET-28a(+)-PBDC1質(zhì)粒的雙酶切鑒定52-53
• 2.2.2.3 重組pET-28a(+)-PBDC1質(zhì)粒的測序鑒定53
• 2.2.3 PBDC1蛋白的表達(dá)、純化及鑒定53-54
• 2.2.3.1 PBDC1蛋白的表達(dá)53
• 2.2.3.2 PBDC1蛋白的純化53-54
• 2.2.3.3 PBDC1蛋白的質(zhì)譜鑒定54
• 2.2.4 PBDC1多克隆抗體的制備、純化及鑒定54-55
• 2.2.4.1 PBDC1多克隆抗體的制備54
• 2.2.4.2 PBDC1多克隆抗體的純化54
• 2.2.4.3 PBDC1多克隆抗體的ELISA檢測54-55
• 2.2.4.4 PBDC1多克隆抗體的Western blot檢測55
• 2.2.5 Western blot檢測PBDC1在MEL細(xì)胞分化中的表達(dá)變化55
• 2.2.6 Real-time PCR檢測PBDC1在MEL細(xì)胞分化中的表達(dá)變化55-56
• 2.2.6.1 熒光定量PCR引物的設(shè)計55
• 2.2.6.2 細(xì)胞總RNA的提取55
• 2.2.6.3 RNA反轉(zhuǎn)錄55
• 2.2.6.4 實時定量PCR55-56
• 3 結(jié)果56-62
• 3.1 PCR擴(kuò)增PBDC1基因56-57
• 3.2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PBDCl的鑒定57-58
• 3.2.1 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PBDC1的PCR鑒定和雙酶切鑒定57
• 3.2.2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PBDC1的測序鑒定57-58
• 3.3 PBDC1蛋白的表達(dá)及可溶性分析58-59
• 3.4 PBDC1蛋白的純化及鑒定59
• 3.5 PBDC1多克隆抗體的ELISA檢測59-60
• 3.6 PBDC1多克隆抗體的Western blot檢測60
• 3.7 PBDC1在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化中逐漸下調(diào)60
• 3.8 PBDC1 mRNA在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化中逐漸下調(diào)60-62
• 4 討論62-63
• 第四章 結(jié)論和展望63-65
• 1 結(jié)論63-64
• 1.1 RbAp48在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化中的功能研究63
• 1.2 PBDC1在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化中的功能研究63-64
• 2 展望64-65
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果69

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 王昊;周東勛;周華邦;汪慧;涂芊茜;胡和平;;肝癌組織中多種自體吞噬的形態(tài)測量學(xué)分析[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2011年03期

2 李蓮蓮;陳若翰;陳淑珍;甄永蘇;古維立;蔡冬青;崔耀隆;李嘉豪;;抗凋亡蛋白BRE、TNFR1和自體吞噬蛋白Beclin1在小鼠肝纖維化的表達(dá)及Reversine對其的影響[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年15期

3 魏s，

本文編號：758166