本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌StkP蛋白疫苗研究

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【摘要】：肺炎鏈球菌會在鼻咽部、支氣管或者肺內(nèi)定殖并引起肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥等疾病，在老年人和兒童中發(fā)病率較高。但近些年來肺炎鏈球菌的耐藥性與多種血清型的問題，使得研制疫苗成為預(yù)防其感染的主要手段。世界衛(wèi)生組織推薦使用上市的肺炎莢膜多糖疫苗和肺炎多糖-蛋白結(jié)合疫苗預(yù)防肺炎鏈球菌感染。然而現(xiàn)存疫苗由于覆蓋的血清型有限、保護(hù)人群具有限制性，使得研制蛋白疫苗的成為重要方法。本論文利用原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建肺炎鏈球菌StkPC314蛋白，評價其作為疫苗候選的免疫原性和免疫保護(hù)性。 本論文選用肺炎鏈球菌絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Serine-Threonine kinaseprotein，StkP）C末端截短314為氨基酸作為蛋白疫苗，命名為StkPC314。將StkPC314基因進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，，設(shè)計合成StkP截短的基因序列后，通過分子克隆構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET20b-stkpC314，使其在大腸桿菌BL21中表達(dá)蛋白。將表達(dá)并純化的后高純度的StkPC314蛋白免疫小鼠，以間接ELISA實驗檢測到高滴度的小鼠血清多抗，說明StkPC314具有較高免疫原性。然后建立肺炎鏈球菌的小鼠腹腔感染模型，通過免疫保護(hù)實驗對StkPC314免疫保護(hù)性進(jìn)行了初步評價。此實驗還確定了最適免疫蛋白劑量為20μg/只，最適免疫佐劑為弗氏佐劑。小鼠肺炎鏈球菌攻毒模型說明StkPC314蛋白有較高免疫原性和免疫保護(hù)性，作為蛋白疫苗候選具有很大的潛力。 為建立StkPC314免疫蛋白原的精確定量方法，本論文通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)篩選出5株能夠分泌特異性StkPC314單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收集、純化得到高純度的單克隆抗體，對單克隆抗體進(jìn)行相對親和力分析、結(jié)合位點(diǎn)的分析、Ig亞類分型等分析。以5株混合單抗作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立間接ELISA方法檢測小鼠抗血清含量，能夠?qū)D450nm為0.3-1.3范圍內(nèi)的小鼠多抗血清進(jìn)行精確定量。為建立有效的抗原蛋白StkPC314檢測方法，將單克隆抗體進(jìn)行生物素化標(biāo)記后，與兔多抗聯(lián)合建立雙抗夾心ELISA方法，實現(xiàn)對抗原StkPC314蛋白精確定量，精確的抗原定量范圍是12.2-97.6ng/ml，抗原蛋白StkPC314的最低檢測線是12.2ng/ml。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 StkP 雙抗夾心ELISA McAb 疫苗
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-10
• 第一章 前言10-21
• 一 肺炎鏈球菌與肺炎疫苗10-15
• （一）肺炎鏈球菌簡介10-12
• （二）肺炎鏈球菌疫苗12-15
• 二 肺炎鏈球菌 STKP 蛋白疫苗候選15-17
• （一）StkP 蛋白的結(jié)構(gòu)15-16
• （二）StkP 蛋白在肺炎鏈球菌細(xì)胞分裂中的作用16
• （三）stkp 基因敲除對肺炎鏈球菌的影響16-17
• （四）StkP 截短蛋白疫苗的研究進(jìn)展17
• 三 ELISA 檢測方法17-19
• （一）單克隆抗體技術(shù)17-18
• （二）免疫酶技術(shù)與 ELISA18-19
• 四 論文設(shè)計19-21
• （一）論文目的19
• （二）實驗設(shè)計19-21
• 第二章 肺炎鏈球菌 STKP 重組蛋白疫苗的評價研究21-46
• 一 材料、試劑與儀器21-25
• （一）菌株、質(zhì)粒、毒株21
• （二）酶及試劑盒21-22
• （三）主要試劑22
• （四）溶液的配制22-25
• （五）主要儀器25
• 二 實驗方法25-30
• （一）重組表達(dá)質(zhì)粒 pET20b-stkp~（C314）的構(gòu)建25-27
• （二）StkP~（C314）蛋白的表達(dá)、純化27-28
• （三）StkP~（C314）蛋白 Western-Blotting 檢測28
• （四）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫原性評價28-29
• （五）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫保護(hù)性29-30
• 三 實驗結(jié)果30-44
• （一）重組蛋白 StkP~（C314）基因片段的設(shè)計30-31
• （二）重組表達(dá)質(zhì)粒 pET20b-stkp~（C314）4的構(gòu)建31-33
• （三）StkP~（C314）蛋白的表達(dá)、純化與兔多抗 Western-Blotting 驗證33-39
• （四）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫原性評價39-40
• （五）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫保護(hù)性研究40-44
• 四 討論44-46
• 第三章 STKP~（C314）蛋白單克隆抗體的制備與 ELISA 檢測方法的建立46-63
• 一 材料、試劑46-47
• （一）細(xì)胞、實驗動物46
• （二）試劑配制46-47
• 二 實驗方法47-53
• （一）StkP~（C314）蛋白單克隆抗體的制備47-51
• （二）間接 ELISA 小鼠血清多抗定量方法的建立51
• （三）StkP~（C314）抗原定量方法的建立51-53
• 三 實驗結(jié)果53-62
• （一）StkP~（C314）蛋白單克隆抗體的制備53-57
• （二）間接 ELISA 小鼠血清多抗定量方法的建立57-58
• （三）雙抗夾心 ELISA 抗原定量方法的建立58-62
• 四 討論62-63
• 結(jié)論63-64
• 附錄 164-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 作者簡介72-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：729906