本文關(guān)鍵詞：miR-125b通過Cbfβ調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： miRNA miR-125b Cbfβ amir-Cbfβ amiRNAs 間充質(zhì)干細(xì)胞 Runx2

【摘要】：研究背景及目的： MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的、不編碼的RNAs，長約21－24核苷酸，在體內(nèi)代謝和干細(xì)胞定向分化過程中發(fā)揮重要作用。miRNA通過與其靶mRNA分子的3' UTR互補(bǔ)結(jié)合,并對其翻譯抑制和直接降解,從而對其表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。近有研究認(rèn)為，干細(xì)胞未分化的某些基因和其譜系特異性基因的保持和激活是通過miRNA的下調(diào)來實(shí)現(xiàn)的，從而被miRNA調(diào)節(jié)成骨、成軟骨等定向分化。MicroRNA-125b (miR-125b)是最早發(fā)現(xiàn)的miRNAs之一，在調(diào)控許多細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）主要存在于機(jī)體骨髓中，其潛能為自我更新及定向分化。在BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中有多種調(diào)節(jié)機(jī)制，并且研究證明這個(gè)分化過程中有不同種類的因子參與。 有文獻(xiàn)報(bào)道提示miR-125b可能是MSC向成骨細(xì)胞分化過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)，明確了Cbfβ是miR-125b的靶基因之一，但miR-125b通過Cbfβ調(diào)節(jié)MSC成骨分化的機(jī)制還需深入研究。因此，本課題研究主要是證實(shí)在MSC成骨分化過程中miR-125b通過靶向結(jié)合Cbfβ的調(diào)控作用，初步探索miR-125b通過靶向Cbfβ調(diào)節(jié)MSC成骨分化的分子機(jī)制。 方法： 1.為探明Cbfβ調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效果，我們構(gòu)建了Cbfβ人工miRNA（artificialmicroRNACbfβ，amir-Cbfβ）干擾載體，并轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞形成穩(wěn)定細(xì)胞株。以空載體為對照組，amir-Cbfβ干擾載體為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行BMP-2誘導(dǎo)后3天檢測Cbfβ、Runx2和ALP表達(dá)，觀察amir-Cbfβ對Cbfβ的抑制作用和對成骨分化的調(diào)控作用。 2.以miR-125b為研究對象，在C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過程中用qRT-PCR檢測miR-125b相對表達(dá)量，從而進(jìn)一步驗(yàn)證本課題組前期基因芯片的結(jié)果。以成骨誘導(dǎo)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，未誘導(dǎo)細(xì)胞為對照組，培養(yǎng)1、3、5天，分析兩組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)miR-125b表達(dá)差異。 3.以Cbfβ、Runx2、成骨標(biāo)志基因ALP、OCN、OPN及成脂基因PPAR-γ為研究對象，，在被BMP-2處理后的C3H10T1/2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-125b mimic、miR-125binhibitor和陰性對照，在1、7、14天分別行qRT-PCR和Western-Blot檢測Cbfβ、Runx2、成骨基因ALP、OC、OPN及成脂基因PPAR-γ表達(dá)量變化，觀察miR-125b作用Cbfβ后對Runx2、成骨基因ALP、OC、OPN及成脂基因PPAR-γ的調(diào)控作用。 4.為了驗(yàn)證成骨標(biāo)志基因ALP、OC、OPN的Western-Blot和qRT-PCR結(jié)果，我們分別將C3H10T1/2細(xì)胞和C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了ALP活性檢測和茜素紅染色。 研究結(jié)果： 1. Cbfβ人工miRNA干擾載體的構(gòu)建和穩(wěn)定細(xì)胞株獲得及鑒定：amir-Cbfβ干擾載體構(gòu)建成功并轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞形成穩(wěn)定細(xì)胞株系，經(jīng)BMP-2誘導(dǎo)3天后用Western-Blot和qRT-PCR檢測Cbfβ、Runx2和ALP蛋白和mRNA的表達(dá)，其結(jié)果是轉(zhuǎn)染干擾載體的較陰性對照的低。 2. qRT-PCR檢結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中miR-125b表達(dá)量較對照組明顯降低（P0.05）。 3. qRT-PCR和Western-Blot結(jié)果顯示：在BMP-2處理后的C3H10T1/2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125b mimic，Cbfβ、Runx2、ALP、OC、OPN蛋白和mRNA表達(dá)量早期（0天、7天）明顯降低，而成脂基因PPAR-γ則升高；用同樣的方式轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor抑制miR-125b，Cbfβ、Runx2、ALP、OC、OPN mRNA和蛋白表達(dá)量早期（0天、7天）明顯升高，而成脂基因PPAR-γ則降低。兩組對14天檢測的變化不明顯。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4. ALP活性檢測和茜素紅染色：在C3H10T1/2細(xì)胞和C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中用BMP-2誘導(dǎo)后分別轉(zhuǎn)染miR-125b mimic和miR-125b inhibitor，14天檢測ALP活性，轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor的較轉(zhuǎn)染miR-125b mimic的高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)，鈣結(jié)節(jié)數(shù)由多到少為：miR-125binhibitor、Control、miR-125b mimic。 結(jié)論： 構(gòu)建的amir-Cbfβ干擾載體可抑制Cbfβ的表達(dá)，并降低Runx2和ALP的表達(dá)，還成功獲得了穩(wěn)定細(xì)胞株系。在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2成骨分化后miR-125b表達(dá)量逐漸降低。在早期成骨分化（0天、7天）中miR-125b通過靶向Cbfβ而負(fù)性調(diào)節(jié)成骨標(biāo)示基因ALP、OC、OPN蛋白及mRNA的表達(dá)，并正性調(diào)節(jié)成脂基因PPAR-γ蛋白及mRNA的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：miRNA miR-125b Cbfβ amir-Cbfβ amiRNAs 間充質(zhì)干細(xì)胞 Runx2
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 Cbfβ人工 miRNA 干擾載體的構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞株的獲得及鑒定15-28
• 2.1 材料與方法15-21
• 2.2 結(jié)果21-25
• 2.3 討論25-27
• 2.4 小結(jié)27-28
• 第三章 miR-125b 通過 Cbfβ調(diào)節(jié) C3H10T1/2 細(xì)胞成骨分化28-47
• 3.1 材料與方法28-35
• 3.2 結(jié)果35-43
• 3.3 討論43-45
• 3.4 小結(jié)45-47
• 全文總結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 文獻(xiàn)綜述52-58
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文58-59
• 致謝59

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本文編號：729818