發(fā)布時(shí)間：2017-08-24 06:08

  本文關(guān)鍵詞：抗菌肽MetalnikowinⅡ?qū)η荻鄽⑿园褪蠗U菌ptfa蛋白免疫效果的研究

  更多相關(guān)文章： 禽多殺性巴氏桿菌ptfa蛋白 原核表達(dá) 免疫佐劑 抗菌肽MetalnikowinII

【摘要】：抗菌肽是指氨基酸數(shù)目小于100，帶正電荷，并具有廣譜抗性及熱穩(wěn)定性的一類小肽。鑒于抗菌肽良好的抗菌活性，目前抗菌肽主要應(yīng)用于抗菌和防腐，近年來抗菌肽被發(fā)現(xiàn)具有免疫佐劑的潛力，并且已經(jīng)得到證實(shí)。本文以人工合成的抗菌肽MetalnikowinII（Met）作為免疫佐劑，，研究其對禽多殺性巴氏桿菌ptfa蛋白的免疫佐劑效果。 本文通過PCR法擴(kuò)增ptfa基因片段，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindIII分別對pET32a質(zhì)粒及ptfa基因片段進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶連接ptfa基因片段與pET32a獲得重組質(zhì)粒pET32a-ptfa， CacL2法轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定，采用鎳柱純化，純化后的ptfa蛋白濃度為140mg/L，冰箱放置備用。 1日齡非免疫雛雞隨機(jī)分為6組，分別為蜂膠佐劑+ptfa蛋白、Met0.2mg++ptfa蛋白+弗氏佐劑組（以下簡稱Met0.2）、Met0.4mg+ptfa蛋白+弗氏佐劑組、Met0.6mg+ptfa蛋白+弗氏佐劑組、ptfa蛋白+弗氏佐劑組及生理鹽水對照組。21日齡時(shí)首免，試驗(yàn)組注射相應(yīng)乳化疫苗（0.4ml/只），對照組肌肉注射等量生理鹽水，42日齡時(shí)二免，于一免后7d、14d、21d、28d、35d、42d進(jìn)行翼下靜脈采血，靜脈血室溫放置，分離血清，-20℃放置備用，并用二免后7d、14d、21d采集外周血進(jìn)行MTT試驗(yàn)。通過ELISA試驗(yàn)檢測靜脈血清中特異性抗體效價(jià)，MTT試驗(yàn)檢測雞體內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，分析ELISA及MTT試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)而評定Met對ptfa蛋白在雞體內(nèi)免疫效果的影響。 本試驗(yàn)成功表達(dá)ptfa蛋白并進(jìn)行純化，免疫試驗(yàn)結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組在二免第二周抗體水平達(dá)到最高，各組抗體水平相對于同時(shí)期的對照組都較高，且差異顯著（P0.05），在一免后的三周內(nèi)，各組抗體水平呈上升趨勢，Met0.4組抗體水平最高，Met0.6組次之，一免之后第三周蜂膠佐劑組與生理鹽水組差異不顯著（P0.05）。在二免之后Met0.2、弗氏佐劑組之間抗體水平接近，Met0.4與Met0.6組抗體水平明顯高于其他三組，Met0.4組血清抗體效價(jià)在二免后第二周達(dá)到最大值，其抗體效價(jià)為1：51200，表明Met作為佐劑對雞的體液免疫起到一定的效果，0.4mg為最佳佐劑劑量。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明在二免第二周各實(shí)驗(yàn)組均達(dá)到最大值，且與生理鹽水對照組相比都有顯著提高，Met0.4、Met0.6組與弗氏佐劑組差異極顯著（P0.01），Met0.2組與弗氏佐劑組之間差異顯著（P0.05），Met0.4組與Met0.6組之間差異顯著（P0.05），因此結(jié)果表明Met0.4可以更有效的促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抗菌肽Met可以有效的促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，綜合判斷Met可以在一定程度上促進(jìn)雛雞的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)以ptfa蛋白為抗原，抗菌肽Met作為佐劑證明抗菌肽Met具有良好的免疫佐劑效果，為現(xiàn)代新型免疫佐劑的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：禽多殺性巴氏桿菌ptfa蛋白 原核表達(dá) 免疫佐劑 抗菌肽MetalnikowinII
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3411;Q51
【目錄】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-9
• 第1章 緒論9-23
• 1.1 抗菌肽的概述9
• 1.2 抗菌肽的分類9-10
• 1.2.1 抗菌肽根據(jù)來源分類9
• 1.2.2 根據(jù)不同結(jié)構(gòu)分類9-10
• 1.3 抗菌肽的生物學(xué)活性10-12
• 1.3.1 抗細(xì)菌活性10-11
• 1.3.2 抗真菌活性11
• 1.3.3 抗原蟲活性11
• 1.3.4 抗病毒活性11
• 1.3.5 抗腫瘤活性11-12
• 1.3.6 在先天性免疫及獲得性免疫中的作用12
• 1.4 抗菌肽的抗菌機(jī)制12-14
• 1.4.1 抗菌肽胞外殺菌機(jī)制12-13
• 1.4.2 抗菌肽胞內(nèi)殺菌機(jī)制13-14
• 1.5 免疫佐劑的概述14-15
• 1.6 免疫佐劑的研究進(jìn)展15-21
• 1.6.1 鋁鹽佐劑15-16
• 1.6.2 MF59 佐劑16
• 1.6.3 細(xì)胞因子佐劑16-18
• 1.6.4 CpG-ODN 佐劑18
• 1.6.5 納米粒子佐劑18-19
• 1.6.6 天然免疫佐劑19-20
• 1.6.7 抗菌肽免疫佐劑20-21
• 1.7 本試驗(yàn)研究意義及試驗(yàn)內(nèi)容21-23
• 第2章 ptfa 蛋白的原核表達(dá)及純化23-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 試驗(yàn)用菌株及原核表達(dá)載體23
• 2.1.2 主要試劑、酶及其試劑盒23
• 2.1.3 試驗(yàn)儀器23-24
• 2.1.4 主要溶液及培養(yǎng)基的配置24-25
• 2.2 試驗(yàn)方法25-31
• 2.2.1 從基因文庫中提取質(zhì)粒及分析25
• 2.2.2 ptfa 基因的 PCR 擴(kuò)增25-26
• 2.2.3 PCR 產(chǎn)物電泳檢測及膠回收26-27
• 2.2.4 ptfa 基因擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收27
• 2.2.5 堿裂解法 pET32a 質(zhì)粒的提取27-28
• 2.2.6 pET32a 載體與目的基因雙酶切及膠回收28
• 2.2.7 pET32a-ptfa 重組載體構(gòu)建28
• 2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)制備及 pET32a-ptfa 重組子的轉(zhuǎn)化及篩選28-29
• 2.2.9 pET32a-ptfa 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)及純化29-31
• 2.3 結(jié)果與分析31-35
• 2.3.1 基因文庫中的重組質(zhì)粒提取及酶切鑒定結(jié)果31-32
• 2.3.2 目的基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果32-33
• 2.3.3 pET32a-ptfa 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果33-34
• 2.3.4 SDS-PAGE 電泳結(jié)果34
• 2.3.5 鎳柱純化后蛋白電泳圖34-35
• 2.4 討論35-37
• 第3章 抗菌肽 Met 對 ptfa 蛋白的免疫效果檢測37-46
• 3.1 試驗(yàn)材料37-38
• 3.1.1 試驗(yàn)動物37
• 3.1.2 主要試劑37
• 3.1.3 本試驗(yàn)所用主要儀器37
• 3.1.4 主要溶液及試劑配制37-38
• 3.2 試驗(yàn)方法38-41
• 3.2.1 試驗(yàn)動物分組及免疫試驗(yàn)38-39
• 3.2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)39
• 3.2.3 靜脈血采集及血清分離39
• 3.2.4 外周血采集39
• 3.2.5 抗原包被濃度的確定39-40
• 3.2.6 雞靜脈血清特異抗體檢測40
• 3.2.7 外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)40-41
• 3.3 結(jié)果與分析41-44
• 3.3.1 抗原包被濃度及血清稀釋濃度的確定41-42
• 3.3.2 雛雞靜脈血特異抗體檢測42-43
• 3.3.3 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)43-44
• 3.4 討論44-46
• 第4章 結(jié)論46-47
• 4.1 pET32a-ptfa 重組載體的原核表達(dá)及蛋白純化46
• 4.2 抗菌肽 Met 對 ptfa 蛋白的免疫效果監(jiān)測46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 縮略語詞匯表53-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：729623