本文關(guān)鍵詞：pNL-hHGF-EGFP慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及表達

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【摘要】：目的： 構(gòu)建含人肝細(xì)胞生長因子（human hepatocyte growth factor， hHGF）基因的慢病毒載體，檢測hHGF基因的mRNA和蛋白在293T細(xì)胞中的表達情況，為研究hHGF基因的功能奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．選擇合適的酶切位點，將hHGF cDNA基因片段（包含有啟動子和多聚腺苷酸A尾）從pUC-SRα-HGF載體酶切獲取，平端連接入慢病毒載體pNL-EGFP，，構(gòu)建重組慢病毒載體pNL-hHGF-EGFP。 2．將pNL-hHGF-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、ELISA方法檢測hHGF基因在293T細(xì)胞中的表達。 3．將pNL-hHGF-EGFP與輔助質(zhì)粒pHELPER、 pVSVG以一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集48h、72h病毒上清，經(jīng)超濾濃縮后，測定病毒滴度，獲得高滴度慢病毒顆粒。 結(jié)果： 1．hHGF cDNA基因片段正確的克隆到pNL-EGFP慢病毒載體上，電泳結(jié)果和酶切鑒定均能得到與理論大小相符合的片段，測序結(jié)果與Genebank序列完全一致。 2．pNL-hHGF-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后綠色熒光蛋白有表達，轉(zhuǎn)染24后RT-PCR檢測到轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中hHGF基因mRNA表達，轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞上清中HGF蛋白含量為52.72±13.09ng/ml。 3．三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞成功獲得慢病毒，測得病毒的滴度為1.5×106TU/ml。 結(jié)論： 1．成功地構(gòu)建了含有人HGF基因的慢病毒載體。 2．pNL-hHGF-EGFP是具有表達功能的慢病毒表達載體。 3．獲得較高的病毒滴度，為其體內(nèi)外研究提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人肝細(xì)胞生長因子 DNA重組 慢病毒
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 第一部分 肝細(xì)胞生長因子基因重組慢病毒表達載體的構(gòu)建12-30
• 1、實驗材料12-17
• 2、技術(shù)路線17-18
• 3、實驗方法18-24
• 4、實驗結(jié)果24-30
• 第二部分 肝細(xì)胞生長因子基因在細(xì)胞中的表達30-45
• 1、實驗材料30-32
• 2、技術(shù)路線32-33
• 3、實驗方法33-40
• 4、實驗結(jié)果40-45
• 討論45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻48-51
• 綜述51-58
• 參考文獻55-58
• 致謝58-59
• 附錄59-62

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 楊宇;陳建英;張如俊;;肝細(xì)胞生長因子對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠炎癥因子的影響[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年13期

2 劉珍君;王俊賢;張如俊;何忠開;陳建英;;氣道內(nèi)滴注肝細(xì)胞生長因子對野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠的干預(yù)研究[J];嶺南心血管病雜志;2014年05期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 邢偉;谷氨酰胺對急性肺損傷大鼠組織修復(fù)的影響[D];中南大學(xué);2013年

2 申冠洋;血清HGF、TGF-β1水平與腦動脈粥樣硬化關(guān)聯(lián)研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2014年

本文編號：729554