本文關(guān)鍵詞：二甲基亞砜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：近年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,物質(zhì)生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變,以心肌梗死為代表的心血管系統(tǒng)疾病在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。由于心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,心肌梗死后,存活的心肌細(xì)胞數(shù)目大量減少,心肌組織由纖維結(jié)締組織代替,瘢痕逐漸形成,導(dǎo)致心功能下降。目前針對心肌梗死等心血管疾病的治療方法有藥物治療、介入治療、外科血運(yùn)重建、激光治療等。但這些治療措施均不能從根本上挽救瀕死的心肌組織。因此,近年來,通過細(xì)胞移植治療心血管疾病已成為研究的熱點(diǎn)之一。而選擇恰當(dāng)?shù)挠糜谝浦驳摹胺N子”細(xì)胞則是決定移植治療心血管疾病成功與否的關(guān)鍵。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞之外的另外一種干細(xì)胞,其具有分布廣泛、取材方便、易分離擴(kuò)增、低免疫源性、易被外源基因轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn),已成為治療心血管系統(tǒng)疾病極有前景的種子細(xì)胞。大量研究證明,BMSCs在一定的誘導(dǎo)條件下可定向分化為心肌細(xì)胞。二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)是目前常用的誘導(dǎo)分化劑之一,其作用機(jī)制主要是通過抑制C-MYC基因表達(dá),從而降低細(xì)胞內(nèi)源性聚腺苷二磷酸核苷水平。 本實(shí)驗(yàn)通過體外分離培養(yǎng)SD大鼠的BMSCs,并用二甲基亞砜誘導(dǎo)使其定向分化為心肌細(xì)胞,對分化過程進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、心肌特異基因及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)加以分析研究,以探討DMSO誘導(dǎo)BMSCs定向分化為心肌細(xì)胞的可行性及最佳誘導(dǎo)濃度,為BMSCs臨床修復(fù)受損心肌組織的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 1BMSCs的誘導(dǎo)分化：利用全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法自3周齡SD大鼠四肢長骨骨髓中分離純化BMSCs,由含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100mg/L,鏈霉素100g/L)組成的IMDM完全培養(yǎng)基在37℃、5%C02條件下進(jìn)行培養(yǎng)。接種后12h半量換液,24h完全更換培養(yǎng)基,此后每隔2d換液。選生長良好的第2代BMSCs分別加入含DMSO(0.6%、0.8%、1.0%)的IMDM培養(yǎng)基分組誘導(dǎo),依次為A、B、C組,不加誘導(dǎo)劑為空白對照組(D組),3d后去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基,之后各組均加入不含DMSO的IMDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周。 2免疫細(xì)胞化學(xué)染色：取各組誘導(dǎo)后第28d的細(xì)胞,行免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)并觀察分化細(xì)胞中結(jié)蛋白(desmin)、α-橫紋肌肌動蛋白(a-actin)、P38MAPK、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的表達(dá)情況。 3免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)：取濃度1.0%DMSO的誘導(dǎo)組培養(yǎng)第28d的細(xì)胞爬片,采用desmin、cTnT進(jìn)行熒光雙重標(biāo)記,觀察二標(biāo)記物在分化細(xì)胞的共表達(dá)情況。 4透射電鏡技術(shù)：取濃度1.0%DMSO的誘導(dǎo)組培養(yǎng)28d生長旺盛、形態(tài)均一的細(xì)胞制備電鏡樣本,2.5%戊二醛固定,刮下全部細(xì)胞,離心制成細(xì)胞團(tuán)塊,常規(guī)脫水包埋,超薄切片后,透射電鏡觀察分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 5相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察：原代細(xì)胞培養(yǎng)24h已有部分貼壁,換液后去除未貼壁的細(xì)胞。在72h可見部分細(xì)胞伸出突起,呈扁平三角形或多邊形,核大而飽滿。1w左右細(xì)胞呈短梭形,體積進(jìn)一步增大。細(xì)胞傳代后形態(tài)排列較為均勻。第2代BMSCs經(jīng)不同濃度DMSO誘導(dǎo)后,細(xì)胞的形態(tài)在不同的時(shí)間段存在差異。A組和B組誘導(dǎo)7d的BMSCs形態(tài)變化不明顯,與對照組類似,隨后則逐漸轉(zhuǎn)變成長柱形。C組BMSCs于誘導(dǎo)后的7d時(shí)形態(tài)已轉(zhuǎn)變成類長柱形,28d時(shí)細(xì)胞體積則變小,排列一致。 6免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：誘導(dǎo)各組的BMSCs中均可見desmin、a-actin、 cTnT、cTnI和P38MAPK的陽性細(xì)胞,而對照組以上各標(biāo)記物則均呈弱陽性或陰性表達(dá)。誘導(dǎo)各組與對照組以上標(biāo)記物的陽性率均具有顯著性差異(P均0.01)。在各誘導(dǎo)組中,各標(biāo)記物的陽性率在C組均最高,顯著高于A、B組(P均0.05)。 7免疫熒光雙標(biāo)染色：分化細(xì)胞胞漿內(nèi)desmin、cTnT呈共表達(dá)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)desmin的表達(dá)呈紅色,cTnT的表達(dá)呈綠色,當(dāng)兩者同時(shí)被觀察時(shí)可見其重疊的部位變成黃色。 8透射電鏡觀察：分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)清晰完整,胞核位于細(xì)胞中央,呈卵圓形,細(xì)胞器豐富而發(fā)達(dá),含有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體,也有糖原和核糖體。胞質(zhì)內(nèi)富含平行排列的肌絲。 形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果證實(shí)DMSO可以在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為心肌樣細(xì)胞并表達(dá)心肌特異性蛋白desmin、α-actin、cTnT、cTnI和P38MAPK,且1.0%DMSO可能是一種合適的誘導(dǎo)濃度。免疫熒光雙標(biāo)染色及電鏡結(jié)果均進(jìn)一步證實(shí)DMSO可以誘導(dǎo)BMSCs獲得心肌分化表型。
【關(guān)鍵詞】：二甲基亞砜 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 心肌細(xì)胞 細(xì)胞誘導(dǎo)分化
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-20
• 1 實(shí)驗(yàn)動物13
• 2 主要試劑13-14
• 3 主要儀器及設(shè)備14
• 4 溶液的配制14-16
• 5 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析20
• 結(jié)果20-22
• 1 大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)學(xué)觀察20-21
• 2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察各組心肌特異性抗原的表達(dá)情況21
• 3 免疫熒光雙標(biāo)染色顯示21
• 4 透射電子顯微鏡觀察21-22
• 附圖22-26
• 附表26-27
• 討論27-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-36
• 綜述 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的鑒定指標(biāo)36-45
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 致謝45-46
• 個(gè)人簡歷46

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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6 文通;魏云峰;王夢洪;汪泱;曾俊義;彭小平;李賓公;;microRNA-1誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2011年01期

7 王海萍;張雷;王浩宇;呂洋;陳煒;邵素霞;;催產(chǎn)素體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2011年11期

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10 李志泉;冼紹祥;汪朝暉;楊忠奇;;三七總皂苷對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向心肌樣細(xì)胞分化的影響[J];廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2007年06期

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本文編號：721685