本文關(guān)鍵詞：預(yù)測的鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白的定位、免疫原性及表達(dá)特性初步研究

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【摘要】：目的 預(yù)測鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci,Cps)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲsecretion system,T3SS)效應(yīng)蛋白編碼基因,研究預(yù)測蛋白在感染細(xì)胞中的定位、免疫原性及其在感染細(xì)胞中的表達(dá)時相,為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。 方法 用計算機(jī)輔助的生物信息學(xué)方法Effective T3.BPBAac tool,以及根據(jù)其他文獻(xiàn)資料,預(yù)測Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因。提取Cps6BC菌株DNA為模板,設(shè)計特異性引物,PCR擴(kuò)增預(yù)測Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因,酶切后連接到載體pGEX-6P-1,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/目的片段,經(jīng)PCR、測序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物；對溫度、IPTG濃度和時間等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后,獲得可溶性表達(dá)蛋白并大量誘導(dǎo)表達(dá)。GST樹脂純化重組蛋白,BCA法測定蛋白濃度；將重組蛋白經(jīng)皮下注入免疫BALB/c小鼠,ELISA法檢測免疫小鼠血清中重組蛋白多克隆抗體的效價,以評價這些蛋白的免疫原性；并以制備的多克隆抗體為抗,應(yīng)用間接免疫熒光檢測預(yù)測蛋白在感染細(xì)胞中的定位。在Cps感染后2、8、24、48h后,用Western blot檢測這些蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了5個可能的Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因：CPSIT0930.CPSIT0767.CPSIT0749.CPSIT0580.CPSIT0420.PCR擴(kuò)增得到其目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和測序證實插入片段為目的基因,測序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示,在IPTG誘導(dǎo)下,對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后,分別表達(dá)了相對分子量(Mr)與預(yù)測分子量相近的可溶性蛋白。重組蛋白經(jīng)GST樹脂純化后,免疫雌性BALB/c小鼠,收集血清,抗CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749抗體效價為1：16000,抗CPSIT_0580、CPSIT0420效價為1：8000。IFA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)現(xiàn)CPSIT_0930、 CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT_0420均定位于包涵體內(nèi)。除CPSIT_0767在Cps感染后48h才開始表達(dá)外,其余蛋白均在感染后2h開始表達(dá),8h后表達(dá)停止。 結(jié)論 1.CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT0420蛋白具有較好的免疫原性； 2. CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT0420蛋白在Cps感染細(xì)胞中定位于包涵體內(nèi)； 3. CPSIT0930、CPSIT0749、CPSIT0580、CPSIT0420蛋白在Cps感染早期表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：鸚鵡熱嗜衣原體 Ⅲ型分泌系統(tǒng) 效應(yīng)蛋白 定位 時相表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R374.2;R392
【目錄】：

• 目錄3-4
• 主要縮略語英文索引4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 實驗材料11-13
• 實驗方法13-23
• 實驗結(jié)果23-29
• 討論29-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-37
• 文獻(xiàn)綜述37-46
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 發(fā)表論文46-47
• 致謝47

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：721975