本文關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A對(duì)GES-1細(xì)胞Rad51表達(dá)的影響及可能機(jī)制的研究

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【摘要】：目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌屬（主要是赭曲霉）和青霉菌屬產(chǎn)生的一種真菌毒素。在世界范圍內(nèi)廣泛存在OTA污染，谷物、蔬菜、咖啡、飲料、動(dòng)物飼料中均有檢測(cè)到OTA的報(bào)道。其毒性作用包括腎毒性、肝毒性、致畸性、免疫毒性、遺傳毒性和致癌性等。1993年國(guó)際癌癥研究中心IARC將OTA歸類為“可能的人類致癌物”。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，OTA可以誘導(dǎo)正常人胃黏膜上皮細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷和G2期阻滯，這可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 哺乳動(dòng)物核蛋白R(shí)ad51，與大腸埃希氏菌重組酶RecA同源，是DNA雙鏈斷裂損傷（DNA double strand breaks, DSBs）精確修復(fù)途徑—同源重組（HR）的核心蛋白，其分子量為37kDa。Rad51家族成員包括：Rad51B、Rad51C、Rad51D、XRCC2和XRCC3，均參與HR修復(fù)過(guò)程。Rad51作為一種轉(zhuǎn)移酶通過(guò)聚集在DNA斷裂末端上形成核蛋白絲，而核蛋白絲可以促進(jìn)被損傷的DNA鏈和未受損傷的同源姊妹染色單體進(jìn)行鏈交換。其表達(dá)異常會(huì)直接影響HR的功能，進(jìn)而影響DSBs的修復(fù)，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，紫外照射、電離輻射和絲裂霉素等因素可以刺激多種細(xì)胞（包括人乳腺癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞和人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞等）Rad51焦點(diǎn)形成并聚集，Rad51表達(dá)增加，從而修復(fù)DSBs。然而在各類細(xì)胞毒性因子刺激下Rad51表達(dá)和細(xì)胞毒性作用（如DNA損傷）之間的關(guān)系依然存在爭(zhēng)議。在黃曲霉毒素B1作用下啤酒酵母菌Rad51被激活，不對(duì)等的姊妹染色單體交換增加，引起基因突變；與此同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)一些化療藥物、缺氧等因素可以使Rad51表達(dá)降低，加重細(xì)胞毒性作用。而目前有關(guān)OTA對(duì)人正常細(xì)胞Rad51的影響國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先探討HR修復(fù)途徑中的關(guān)鍵分子Rad51在OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞DSBs以及G2期阻滯中的作用；接著進(jìn)一步揭示影響Rad51表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制。這將為評(píng)價(jià)OTA在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的可能作用提供科學(xué)依據(jù)。 方法：1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 正常人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）常規(guī)培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100U/ml鏈霉素、100U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（傳代后24h）隨機(jī)的分為溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。溶劑對(duì)照組給予終濃度為0.08%的甲醇（以前的研究顯示，當(dāng)甲醇終濃度為0.08%時(shí)，通過(guò)MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析其對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布均無(wú)影響）。實(shí)驗(yàn)組分別給予經(jīng)甲醇稀釋后終濃度為5μM、10μM和20μM的OTA，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞或者給予終濃度為20μM的OTA，而后培養(yǎng)6h、12h和24h后分次收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。2p38和ERK阻斷劑處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞分別給予p38的阻斷劑SB20358010μM或ERK的阻斷劑PD9805910μM預(yù)處理0.5h，其后加入20μM OTA培養(yǎng)24h，再收集細(xì)胞檢測(cè)Rad51的表達(dá)。3p53siRNA轉(zhuǎn)染和Rad51質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用100pmol p53特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，再加入20μM OTA繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。其陰性對(duì)照為Negtivecontrol siRNA（NC siRNA）。2μg表達(dá)Rad51的質(zhì)粒和作為陰性對(duì)照的空質(zhì)粒也被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)GES-1細(xì)胞中，在此基礎(chǔ)上加入20μM OTA繼續(xù)培養(yǎng)24h，再收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。4蛋白免疫印跡（Western blot） 各種因素處理GES-1細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白免疫印跡方法，檢測(cè)OTA處理后人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中各種指標(biāo)的表達(dá)情況。5實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time PCR） 利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同處理方式對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中Rad51mRNA表達(dá)的影響。每組樣品以目的基因與內(nèi)參照基因人類管家基因β-actin量的比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量,用比較Ct值的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence staining） GES-1細(xì)胞固定后用Rad51一抗和熒光二抗孵育，再用DAPI復(fù)染DNA。最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察OTA處理細(xì)胞后Rad51的表達(dá)情況并拍照。7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期（FCM） 轉(zhuǎn)染和OTA處理后，分別收集各組細(xì)胞，再PBS洗滌，離心收集細(xì)胞，用70%冰乙醇固定后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。8免疫共沉淀（IP） 提取GES-1細(xì)胞總蛋白120μg，各組蛋白加入5μg CyclinB1抗體4℃搖床過(guò)夜，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成情況。9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每組實(shí)驗(yàn)不少于3次獨(dú)立樣本的重復(fù)，采用SPSS軟件（13.0）進(jìn)行相關(guān)與回歸分析（analysis of Correlation and Regression）、t檢驗(yàn)和單因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），數(shù)據(jù)用x±s表示，檢驗(yàn)以P0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果：1OTA通過(guò)劑量和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX蛋白表達(dá)的增加 Western blot結(jié)果顯示，和溶劑對(duì)照組相比，5μM、10μM和20μM OTA處理24h后，γ-H2AX蛋白表達(dá)水平呈逐漸上升的趨勢(shì)(r=0.895, P0.05)。同時(shí)，20μM OTA處理細(xì)胞6h、12h和24h后，γ-H2AX蛋白水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也明顯升高(r=0.926, P0.05)。2OTA通過(guò)劑量和時(shí)間依賴的方式抑制GES-1細(xì)胞Rad51在mRNA及蛋白水平的表達(dá)2.1Rad51在mRNA水平上的表達(dá)： Real-time PCR結(jié)果顯示，5μM、10μM和20μM OTA處理GES-1細(xì)胞24h后，Rad51在mRNA水平上的表達(dá)逐漸降低(r=-0.909, P0.05)。20μM OTA（此劑量抑制Rad51表達(dá)最明顯）分別處理GES-1細(xì)胞6h、12h和24h后，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，Rad51在mRNA水平上的表達(dá)也逐漸降低(r=-0.984, P0.05)。2.2Rad51在蛋白水平上的表達(dá)： 與mRNA水平上的表達(dá)一致的是，Western blot結(jié)果顯示，和溶劑對(duì)照組相比，OTA5μM、10μM和20μM處理24h后，Rad51蛋白表達(dá)水平呈逐漸降低的趨勢(shì)(r=-0.952, P0.05)。同時(shí)，OTA20μM處理細(xì)胞6h、12h和24h后，Rad51蛋白水平的表達(dá)水平也逐漸降低(r=-0.989, P0.05)。 2.3OTA導(dǎo)致GES-1細(xì)胞Rad51焦點(diǎn)的數(shù)量減少免疫熒光結(jié)果顯示，20μM OTA處理的細(xì)胞中Rad51焦點(diǎn)的數(shù)量明顯少于溶劑對(duì)照組（P0.05）。以上結(jié)果提示OTA可以下調(diào)Rad51的表達(dá)，進(jìn)而抑制HR修復(fù)途徑。 3利用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Rad51可逆轉(zhuǎn)OTA對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷作用 3.1Rad51過(guò)表達(dá)對(duì)OTA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞DSBs的影響 Western blot結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒+OTA組相比，Rad51質(zhì)粒+OTA組中γ-H2AX的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P0.05）。結(jié)果提示Rad51過(guò)表達(dá)可以抑制OTA誘導(dǎo)的DSBs的發(fā)生。 3.2Rad51過(guò)表達(dá)對(duì)OTA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞G2期阻滯的影響 FCM結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rad51質(zhì)粒+OTA組中G2/M期細(xì)胞比例與空質(zhì)粒+OTA組相比明顯降低（P0.05）。結(jié)果提示Rad51過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)OTA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞G2阻滯。 Western blot結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒+OTA組相比，Rad51質(zhì)粒+OTA處理組G2/M期關(guān)鍵蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表達(dá)水平明顯增加（P0.05）。同時(shí)免疫共沉淀結(jié)果顯示，Rad51質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，與空質(zhì)粒+OTA處理組相比，Rad51質(zhì)粒+OTA處理組Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成明顯增多（P0.05）。4OTA處理引起GES-1細(xì)胞Rad51降低的可能分子機(jī)制 我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，，OTA處理后的GES-1細(xì)胞可激活ERK、p38和p53信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控OTA誘導(dǎo)的G2阻滯。4.1ERK和p38信號(hào)通路在OTA下調(diào)GES-1細(xì)胞Rad51表達(dá)中的作用 Western blot結(jié)果顯示，與OTA處理組相比，ERK特異性阻斷劑（PD98059）預(yù)處理+OTA處理組Rad51的表達(dá)明顯升高（P0.05）。同時(shí)，p38特異性阻斷劑（SB203580）預(yù)處理也抑制了OTA導(dǎo)致的Rad51表達(dá)降低（P0.05）。結(jié)果提示ERK和p38信號(hào)通路可能是OTA下調(diào)GES-1細(xì)胞Rad51表達(dá)的機(jī)制之一。4.2p53在OTA下調(diào)GES-1細(xì)胞Rad51表達(dá)中的作用 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，p53siRNA+OTA處理組細(xì)胞中Rad51蛋白的表達(dá)水平與NC siRNA+OTA處理組相比明顯增加（P0.05）。結(jié)果表明，p53基因的激活參與調(diào)節(jié)了OTA引起的GES-1細(xì)胞Rad51表達(dá)降低。 結(jié)論： 1赭曲霉毒素A處理引起GES-1細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷，同時(shí)抑制細(xì)胞中Rad51的表達(dá)。 2過(guò)表達(dá)Rad51可以顯著逆轉(zhuǎn)赭曲霉毒素A誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷作用。 3過(guò)表達(dá)Rad51可以緩解赭曲霉毒素A誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞G2期阻滯。 4ERK和p38MAPK信號(hào)通路以及p53基因的激活參與赭曲霉毒素A抑制Rad51表達(dá)的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：Rad51 同源重組修復(fù)途徑 赭曲霉毒素 人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞 DNA 雙鏈斷裂 G2期阻滯
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-18
• 材料與方法18-30
• 結(jié)果30-33
• 附圖33-45
• 附表45-46
• 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 綜述 DNA 損傷修復(fù)和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)阻滯對(duì)維持基因組穩(wěn)定性的重要意義的研究進(jìn)展56-69
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 致謝69-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

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1 高t熻

本文編號(hào)：713833