本文關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A對GES-1細胞Rad51表達的影響及可能機制的研究

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【摘要】：目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌屬（主要是赭曲霉）和青霉菌屬產(chǎn)生的一種真菌毒素。在世界范圍內(nèi)廣泛存在OTA污染，谷物、蔬菜、咖啡、飲料、動物飼料中均有檢測到OTA的報道。其毒性作用包括腎毒性、肝毒性、致畸性、免疫毒性、遺傳毒性和致癌性等。1993年國際癌癥研究中心IARC將OTA歸類為“可能的人類致癌物”。本實驗室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，OTA可以誘導(dǎo)正常人胃黏膜上皮細胞DNA雙鏈斷裂損傷和G2期阻滯，這可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 哺乳動物核蛋白Rad51，與大腸埃希氏菌重組酶RecA同源，是DNA雙鏈斷裂損傷（DNA double strand breaks, DSBs）精確修復(fù)途徑—同源重組（HR）的核心蛋白，其分子量為37kDa。Rad51家族成員包括：Rad51B、Rad51C、Rad51D、XRCC2和XRCC3，均參與HR修復(fù)過程。Rad51作為一種轉(zhuǎn)移酶通過聚集在DNA斷裂末端上形成核蛋白絲，而核蛋白絲可以促進被損傷的DNA鏈和未受損傷的同源姊妹染色單體進行鏈交換。其表達異常會直接影響HR的功能，進而影響DSBs的修復(fù)，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，紫外照射、電離輻射和絲裂霉素等因素可以刺激多種細胞（包括人乳腺癌細胞、人鼻咽癌細胞和人結(jié)腸黏膜上皮細胞等）Rad51焦點形成并聚集，Rad51表達增加，從而修復(fù)DSBs。然而在各類細胞毒性因子刺激下Rad51表達和細胞毒性作用（如DNA損傷）之間的關(guān)系依然存在爭議。在黃曲霉毒素B1作用下啤酒酵母菌Rad51被激活，不對等的姊妹染色單體交換增加，引起基因突變；與此同時，還有研究發(fā)現(xiàn)一些化療藥物、缺氧等因素可以使Rad51表達降低，加重細胞毒性作用。而目前有關(guān)OTA對人正常細胞Rad51的影響國內(nèi)外均未見報道。本實驗首先探討HR修復(fù)途徑中的關(guān)鍵分子Rad51在OTA誘導(dǎo)GES-1細胞DSBs以及G2期阻滯中的作用；接著進一步揭示影響Rad51表達的上游調(diào)控機制。這將為評價OTA在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的可能作用提供科學(xué)依據(jù)。 方法：1細胞培養(yǎng)與處理 正常人胃黏膜上皮細胞（GES-1）常規(guī)培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100U/ml鏈霉素、100U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長。選擇對數(shù)生長期的細胞（傳代后24h）隨機的分為溶劑對照組和實驗組。溶劑對照組給予終濃度為0.08%的甲醇（以前的研究顯示，當(dāng)甲醇終濃度為0.08%時，通過MTT和流式細胞術(shù)檢測分析其對細胞增殖和細胞周期分布均無影響）。實驗組分別給予經(jīng)甲醇稀釋后終濃度為5μM、10μM和20μM的OTA，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細胞或者給予終濃度為20μM的OTA，而后培養(yǎng)6h、12h和24h后分次收集細胞進行相關(guān)指標(biāo)檢測。2p38和ERK阻斷劑處理 取對數(shù)生長期GES-1細胞分別給予p38的阻斷劑SB20358010μM或ERK的阻斷劑PD9805910μM預(yù)處理0.5h，其后加入20μM OTA培養(yǎng)24h，再收集細胞檢測Rad51的表達。3p53siRNA轉(zhuǎn)染和Rad51質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用100pmol p53特異性siRNA轉(zhuǎn)染細胞24h后，再加入20μM OTA繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后收集細胞進行相關(guān)指標(biāo)檢測。其陰性對照為Negtivecontrol siRNA（NC siRNA）。2μg表達Rad51的質(zhì)粒和作為陰性對照的空質(zhì)粒也被瞬時轉(zhuǎn)染進GES-1細胞中，在此基礎(chǔ)上加入20μM OTA繼續(xù)培養(yǎng)24h，再收集細胞進行相關(guān)指標(biāo)檢測。4蛋白免疫印跡（Western blot） 各種因素處理GES-1細胞后，提取細胞總蛋白，用蛋白免疫印跡方法，檢測OTA處理后人胃黏膜上皮細胞GES-1中各種指標(biāo)的表達情況。5實時定量PCR（Quantitative real-time PCR） 利用實時定量PCR檢測不同處理方式對人胃黏膜上皮細胞GES-1中Rad51mRNA表達的影響。每組樣品以目的基因與內(nèi)參照基因人類管家基因β-actin量的比值表示目的基因相對表達量,用比較Ct值的方法進行統(tǒng)計學(xué)分析。6免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence staining） GES-1細胞固定后用Rad51一抗和熒光二抗孵育，再用DAPI復(fù)染DNA。最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察OTA處理細胞后Rad51的表達情況并拍照。7流式細胞術(shù)檢測細胞周期（FCM） 轉(zhuǎn)染和OTA處理后，分別收集各組細胞，再PBS洗滌，離心收集細胞，用70%冰乙醇固定后利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布情況。8免疫共沉淀（IP） 提取GES-1細胞總蛋白120μg，各組蛋白加入5μg CyclinB1抗體4℃搖床過夜，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成情況。9統(tǒng)計學(xué)分析 每組實驗不少于3次獨立樣本的重復(fù)，采用SPSS軟件（13.0）進行相關(guān)與回歸分析（analysis of Correlation and Regression）、t檢驗和單因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），數(shù)據(jù)用x±s表示，檢驗以P0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果：1OTA通過劑量和時間依賴的方式誘導(dǎo)GES-1細胞DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX蛋白表達的增加 Western blot結(jié)果顯示，和溶劑對照組相比，5μM、10μM和20μM OTA處理24h后，γ-H2AX蛋白表達水平呈逐漸上升的趨勢(r=0.895, P0.05)。同時，20μM OTA處理細胞6h、12h和24h后，γ-H2AX蛋白水平隨著時間的延長也明顯升高(r=0.926, P0.05)。2OTA通過劑量和時間依賴的方式抑制GES-1細胞Rad51在mRNA及蛋白水平的表達2.1Rad51在mRNA水平上的表達： Real-time PCR結(jié)果顯示，5μM、10μM和20μM OTA處理GES-1細胞24h后，Rad51在mRNA水平上的表達逐漸降低(r=-0.909, P0.05)。20μM OTA（此劑量抑制Rad51表達最明顯）分別處理GES-1細胞6h、12h和24h后，隨著處理時間延長，Rad51在mRNA水平上的表達也逐漸降低(r=-0.984, P0.05)。2.2Rad51在蛋白水平上的表達： 與mRNA水平上的表達一致的是，Western blot結(jié)果顯示，和溶劑對照組相比，OTA5μM、10μM和20μM處理24h后，Rad51蛋白表達水平呈逐漸降低的趨勢(r=-0.952, P0.05)。同時，OTA20μM處理細胞6h、12h和24h后，Rad51蛋白水平的表達水平也逐漸降低(r=-0.989, P0.05)。 2.3OTA導(dǎo)致GES-1細胞Rad51焦點的數(shù)量減少免疫熒光結(jié)果顯示，20μM OTA處理的細胞中Rad51焦點的數(shù)量明顯少于溶劑對照組（P0.05）。以上結(jié)果提示OTA可以下調(diào)Rad51的表達，進而抑制HR修復(fù)途徑。 3利用質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Rad51可逆轉(zhuǎn)OTA對GES-1細胞的損傷作用 3.1Rad51過表達對OTA誘導(dǎo)的GES-1細胞DSBs的影響 Western blot結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒+OTA組相比，Rad51質(zhì)粒+OTA組中γ-H2AX的蛋白表達水平明顯降低（P0.05）。結(jié)果提示Rad51過表達可以抑制OTA誘導(dǎo)的DSBs的發(fā)生。 3.2Rad51過表達對OTA誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯的影響 FCM結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rad51質(zhì)粒+OTA組中G2/M期細胞比例與空質(zhì)粒+OTA組相比明顯降低（P0.05）。結(jié)果提示Rad51過表達可以逆轉(zhuǎn)OTA誘導(dǎo)的GES-1細胞G2阻滯。 Western blot結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒+OTA組相比，Rad51質(zhì)粒+OTA處理組G2/M期關(guān)鍵蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表達水平明顯增加（P0.05）。同時免疫共沉淀結(jié)果顯示，Rad51質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，與空質(zhì)粒+OTA處理組相比，Rad51質(zhì)粒+OTA處理組Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成明顯增多（P0.05）。4OTA處理引起GES-1細胞Rad51降低的可能分子機制 我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，，OTA處理后的GES-1細胞可激活ERK、p38和p53信號通路，進而調(diào)控OTA誘導(dǎo)的G2阻滯。4.1ERK和p38信號通路在OTA下調(diào)GES-1細胞Rad51表達中的作用 Western blot結(jié)果顯示，與OTA處理組相比，ERK特異性阻斷劑（PD98059）預(yù)處理+OTA處理組Rad51的表達明顯升高（P0.05）。同時，p38特異性阻斷劑（SB203580）預(yù)處理也抑制了OTA導(dǎo)致的Rad51表達降低（P0.05）。結(jié)果提示ERK和p38信號通路可能是OTA下調(diào)GES-1細胞Rad51表達的機制之一。4.2p53在OTA下調(diào)GES-1細胞Rad51表達中的作用 Western blot檢測結(jié)果顯示，p53siRNA+OTA處理組細胞中Rad51蛋白的表達水平與NC siRNA+OTA處理組相比明顯增加（P0.05）。結(jié)果表明，p53基因的激活參與調(diào)節(jié)了OTA引起的GES-1細胞Rad51表達降低。 結(jié)論： 1赭曲霉毒素A處理引起GES-1細胞DNA雙鏈斷裂損傷，同時抑制細胞中Rad51的表達。 2過表達Rad51可以顯著逆轉(zhuǎn)赭曲霉毒素A誘導(dǎo)的GES-1細胞DNA雙鏈斷裂損傷作用。 3過表達Rad51可以緩解赭曲霉毒素A誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯。 4ERK和p38MAPK信號通路以及p53基因的激活參與赭曲霉毒素A抑制Rad51表達的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：Rad51 同源重組修復(fù)途徑 赭曲霉毒素 人永生化胃黏膜上皮細胞 DNA 雙鏈斷裂 G2期阻滯
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-18
• 材料與方法18-30
• 結(jié)果30-33
• 附圖33-45
• 附表45-46
• 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-56
• 綜述 DNA 損傷修復(fù)和細胞周期檢測點阻滯對維持基因組穩(wěn)定性的重要意義的研究進展56-69
• 參考文獻63-69
• 致謝69-71
• 個人簡歷71

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