本文關鍵詞：諾如病毒熒光定量檢測方法的建立及兩種病毒感染性克隆構建的初步探索

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【摘要】：目的：建立同時檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒的雙重熒光定量一步RT-PCR方法,使其在對諾如病毒的檢測過程中,可以同時完成定量和分型。并建立檢測GⅣ型諾如病毒的熒光定量一步RT-PCR方法。此外,應用分子生物學技術,尤其是諾如病毒屬其他成員的研究方法,獲得諾如病毒的全基因組克隆,并利用建立的real-time檢測方法及相對定量方法,對此全基因組克隆轉錄物的轉染效果進行評價。以期為人諾如病毒的研究奠定一定的理論和技術基礎。 應用分子生物學技術,獲得C組鼻病毒的全基因組克隆,并利用相對定量的方法,對此全基因組克隆轉錄物的轉染效果進行評價。以期為對C組鼻病毒的進一步研究提供基礎。 方法： (一)雙重熒光定量一步RT-PCR法同時檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒 應用針對GⅠ、GⅡ型諾如病毒的特異性引物以及Taqman探針,優(yōu)化反應體系及條件,構建熒光定量檢測的RNA標準品,建立同時檢測GⅠ、GⅡ型的雙重熒光定量一步RT-PCR方法。對該方法的靈敏度、特異性、重復性進行評估。同時對糞便標本進行檢測,并以傳統(tǒng)RT-PCR的方法作為參考,對熒光定量方法進行評價。 (二)熒光定量一步RT-PCR法對GⅣ型諾如病毒檢測方法的建立 應用針對GⅣ型諾如病毒的特異性引物以及Taqman探針,優(yōu)化反應體系及條件,構建熒光定量檢測的RNA標準品,建立檢測GⅣ型的熒光定量一步RT-PCR方法。對該方法的特異性、重復性進行評估。同時對本實驗發(fā)現(xiàn)的GⅣ型陽性標本進行檢測,并以傳統(tǒng)RT-PCR的方法對其檢測,從而驗證熒光定量方法結果。 (三)對兩種難培養(yǎng)病毒感染性克隆構建的初步探索 將已獲得全基因組序列的一株人諾如病毒和一株C組鼻病毒樣本進行分段RT-PCR,通過人工合成或RT-PCR的方法,在病毒全基因組的5’端加上T7啟動子序列,而在3’端加上Poly(A)尾結構,并利用酶切連接的方法,最終獲得兩種病毒的全基因組克隆。對病毒的全基因組克隆進行體外轉錄,在轉錄過程中加入帽子結構類似物,此結構以及Poly(A)尾結構,可以保證病毒基因組體外轉錄的RNA的穩(wěn)定性,另夕(?)Poly(A)尾結構也可能和病毒的感染效力有關。獲得基因組RNA后,將諾如病毒的基因組RNA轉染入293細胞,將C組鼻病毒的基因組RNA轉染入Hela細胞,并通過相對定量的方法,觀察病毒在轉染細胞內的復制情況。 結果： (一)建立了雙重熒光定量一步RT-PCR法同時檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒的方法,其在103拷貝水平可穩(wěn)定檢測出GⅠ和GⅡ型諾如病毒。結果表明,該方法特異性強,與腸道腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒均無交叉反應。經重復性實驗驗證,其CT值變異系數(CV)均小于5%,表明有較好的重復性。用該方法對100份糞便標本進行檢測,諾如病毒的陽性率為31%,其中GⅠ型為3%,GⅡ型為28%,而傳統(tǒng)RT-PCR法的檢出率為22%。其與普通RT-PCR相比具有靈敏度高、定量準確的優(yōu)勢。 (二)建立了熒光定量一步RT-PCR法檢測GⅣ型諾如病毒的方法,其在102拷貝水平可穩(wěn)定檢測出GⅣ型諾如病毒。結果表明,該方法特異性強,與GⅠ、GⅡ型諾如病毒、腸道腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒均無交叉反應。經重復性實驗驗證,其CT值變異系數(CV)均小于5%,表明有較好的重復性。其與普通RT-PCR相比具有靈敏度高、定量準確的優(yōu)勢。 (三)對兩種難培養(yǎng)病毒——諾如病毒和C組鼻病毒的感染性克隆,進行了初步探索,獲得了兩種病毒的全基因組克隆,用相對定量的方法對轉染細胞內病毒核酸的擴增進行檢測,最終發(fā)現(xiàn)了諾如病毒和C組鼻病毒在核酸水平上,分別有約4.5倍和1.9倍的增加。并在細胞水平觀察到了轉染細胞的病變效應。 結論：本研究建立了對感染人的三個型別的諾如病毒的熒光定量檢測方法。同時檢測GⅠ、GⅡ型的雙重熒光定量一步RT-PCR法,以及GⅣ型的熒光定量一步RT-PCR方法效果良好,二者的靈敏度高、特異性好�？蓱糜谖改c炎病人中諾如病毒的檢測。對G1V諾如病毒的檢測也填補了國內的空白。 本研究對兩種難培養(yǎng)病毒的感染性克隆構建進行了初步探索,發(fā)現(xiàn)了諾如病毒和C組鼻病毒在核酸水平的擴增。并在細胞水平發(fā)現(xiàn)了轉染細胞的病變效應。為后續(xù)對諾如病毒和C組鼻病毒的研究奠定了一定的理論和技術基礎。
【關鍵詞】：諾如病毒 C組鼻病毒 雙重 熒光定量 感染性克隆
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 主要英文縮略語6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 第一篇 諾如病毒熒光定量檢測方法的建立14-33
• 前言14-15
• 第一章 雙重熒光定量一步RT-PCR法同時檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒15-24
• 材料方法15-21
• 結果21-24
• 第二章 熒光定量一步RT-PCR法對GⅣ型諾如病毒檢測方法的建立24-32
• 材料方法24-29
• 結果29-32
• 討論32-33
• 第二篇 對兩種病毒感染性克隆構建的初步探索33-58
• 前言33-36
• 第一章 諾如病毒感染性克隆的構建的初步探索36-47
• 材料方法36-45
• 結果45-47
• 第二章 C組鼻病毒感染性克隆的構建的初步探索47-56
• 材料方法47-54
• 結果54-56
• 討論56-58
• 全文總結58-59
• 綜述59-63
• 參考文獻63-67
• 致謝67-68
• 個人簡歷68

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前9條

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本文編號：709736