本文關(guān)鍵詞：諾如病毒熒光定量檢測(cè)方法的建立及兩種病毒感染性克隆構(gòu)建的初步探索

  更多相關(guān)文章： 諾如病毒 C組鼻病毒 雙重 熒光定量 感染性克隆

【摘要】：目的：建立同時(shí)檢測(cè)GⅠ、GⅡ型諾如病毒的雙重?zé)晒舛恳徊絉T-PCR方法,使其在對(duì)諾如病毒的檢測(cè)過程中,可以同時(shí)完成定量和分型。并建立檢測(cè)GⅣ型諾如病毒的熒光定量一步RT-PCR方法。此外,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),尤其是諾如病毒屬其他成員的研究方法,獲得諾如病毒的全基因組克隆,并利用建立的real-time檢測(cè)方法及相對(duì)定量方法,對(duì)此全基因組克隆轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。以期為人諾如病毒的研究奠定一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),獲得C組鼻病毒的全基因組克隆,并利用相對(duì)定量的方法,對(duì)此全基因組克隆轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。以期為對(duì)C組鼻病毒的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。 方法： (一)雙重?zé)晒舛恳徊絉T-PCR法同時(shí)檢測(cè)GⅠ、GⅡ型諾如病毒 應(yīng)用針對(duì)GⅠ、GⅡ型諾如病毒的特異性引物以及Taqman探針,優(yōu)化反應(yīng)體系及條件,構(gòu)建熒光定量檢測(cè)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,建立同時(shí)檢測(cè)GⅠ、GⅡ型的雙重?zé)晒舛恳徊絉T-PCR方法。對(duì)該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),并以傳統(tǒng)RT-PCR的方法作為參考,對(duì)熒光定量方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。 (二)熒光定量一步RT-PCR法對(duì)GⅣ型諾如病毒檢測(cè)方法的建立 應(yīng)用針對(duì)GⅣ型諾如病毒的特異性引物以及Taqman探針,優(yōu)化反應(yīng)體系及條件,構(gòu)建熒光定量檢測(cè)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,建立檢測(cè)GⅣ型的熒光定量一步RT-PCR方法。對(duì)該方法的特異性、重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)對(duì)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的GⅣ型陽性標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),并以傳統(tǒng)RT-PCR的方法對(duì)其檢測(cè),從而驗(yàn)證熒光定量方法結(jié)果。 (三)對(duì)兩種難培養(yǎng)病毒感染性克隆構(gòu)建的初步探索 將已獲得全基因組序列的一株人諾如病毒和一株C組鼻病毒樣本進(jìn)行分段RT-PCR,通過人工合成或RT-PCR的方法,在病毒全基因組的5’端加上T7啟動(dòng)子序列,而在3’端加上Poly(A)尾結(jié)構(gòu),并利用酶切連接的方法,最終獲得兩種病毒的全基因組克隆。對(duì)病毒的全基因組克隆進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,在轉(zhuǎn)錄過程中加入帽子結(jié)構(gòu)類似物,此結(jié)構(gòu)以及Poly(A)尾結(jié)構(gòu),可以保證病毒基因組體外轉(zhuǎn)錄的RNA的穩(wěn)定性,另夕(?)Poly(A)尾結(jié)構(gòu)也可能和病毒的感染效力有關(guān)。獲得基因組RNA后,將諾如病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞,將C組鼻病毒的基因組RNA轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞,并通過相對(duì)定量的方法,觀察病毒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。 結(jié)果： (一)建立了雙重?zé)晒舛恳徊絉T-PCR法同時(shí)檢測(cè)GⅠ、GⅡ型諾如病毒的方法,其在103拷貝水平可穩(wěn)定檢測(cè)出GⅠ和GⅡ型諾如病毒。結(jié)果表明,該方法特異性強(qiáng),與腸道腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒均無交叉反應(yīng)。經(jīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,其CT值變異系數(shù)(CV)均小于5%,表明有較好的重復(fù)性。用該方法對(duì)100份糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),諾如病毒的陽性率為31%,其中GⅠ型為3%,GⅡ型為28%,而傳統(tǒng)RT-PCR法的檢出率為22%。其與普通RT-PCR相比具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。 (二)建立了熒光定量一步RT-PCR法檢測(cè)GⅣ型諾如病毒的方法,其在102拷貝水平可穩(wěn)定檢測(cè)出GⅣ型諾如病毒。結(jié)果表明,該方法特異性強(qiáng),與GⅠ、GⅡ型諾如病毒、腸道腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒均無交叉反應(yīng)。經(jīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,其CT值變異系數(shù)(CV)均小于5%,表明有較好的重復(fù)性。其與普通RT-PCR相比具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。 (三)對(duì)兩種難培養(yǎng)病毒——諾如病毒和C組鼻病毒的感染性克隆,進(jìn)行了初步探索,獲得了兩種病毒的全基因組克隆,用相對(duì)定量的方法對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)病毒核酸的擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè),最終發(fā)現(xiàn)了諾如病毒和C組鼻病毒在核酸水平上,分別有約4.5倍和1.9倍的增加。并在細(xì)胞水平觀察到了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病變效應(yīng)。 結(jié)論：本研究建立了對(duì)感染人的三個(gè)型別的諾如病毒的熒光定量檢測(cè)方法。同時(shí)檢測(cè)GⅠ、GⅡ型的雙重?zé)晒舛恳徊絉T-PCR法,以及GⅣ型的熒光定量一步RT-PCR方法效果良好,二者的靈敏度高、特異性好�？蓱�(yīng)用于胃腸炎病人中諾如病毒的檢測(cè)。對(duì)G1V諾如病毒的檢測(cè)也填補(bǔ)了國內(nèi)的空白。 本研究對(duì)兩種難培養(yǎng)病毒的感染性克隆構(gòu)建進(jìn)行了初步探索,發(fā)現(xiàn)了諾如病毒和C組鼻病毒在核酸水平的擴(kuò)增。并在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病變效應(yīng)。為后續(xù)對(duì)諾如病毒和C組鼻病毒的研究奠定了一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：諾如病毒 C組鼻病毒 雙重 熒光定量 感染性克隆
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 主要英文縮略語6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 第一篇 諾如病毒熒光定量檢測(cè)方法的建立14-33
• 前言14-15
• 第一章 雙重?zé)晒舛恳徊絉T-PCR法同時(shí)檢測(cè)GⅠ、GⅡ型諾如病毒15-24
• 材料方法15-21
• 結(jié)果21-24
• 第二章 熒光定量一步RT-PCR法對(duì)GⅣ型諾如病毒檢測(cè)方法的建立24-32
• 材料方法24-29
• 結(jié)果29-32
• 討論32-33
• 第二篇 對(duì)兩種病毒感染性克隆構(gòu)建的初步探索33-58
• 前言33-36
• 第一章 諾如病毒感染性克隆的構(gòu)建的初步探索36-47
• 材料方法36-45
• 結(jié)果45-47
• 第二章 C組鼻病毒感染性克隆的構(gòu)建的初步探索47-56
• 材料方法47-54
• 結(jié)果54-56
• 討論56-58
• 全文總結(jié)58-59
• 綜述59-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號(hào)：709736