本文關鍵詞：uPA和VEGF165單基因真核質粒共轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞對細胞增殖的影響

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【摘要】：目的： 構建尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和人血管內(nèi)皮細胞生長因子165（VEGF165）單基因真核表達質粒，并將uPA和VEGF165單基因真核表達質粒共轉染至人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），檢測其轉染后uPA、VEGF165的表達及對細胞增殖的影響。 方法： 1. uPA和VEGF165單基因真核表達質粒的構建：設計帶酶切位點的PCR引物以及合成引物；常規(guī)培養(yǎng)HUVECs，提取RNA逆轉錄成cDNA；通過PCR對VEGF165及uPA基因片段擴增并引入新的酶切位點；將其分別定向連入真核表達載體pIRES2-EGFP，構建表達目的基因的單順反子，并轉化至感受態(tài)細胞。通過PCR、酶切分析及DNA序列測定鑒定重組質粒pIRES2/EGFP-VEGF165和pIRES2/EGFP-uPA。 2.重組質粒擴增后經(jīng)脂質體介導體外轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞，分組為A組(PBS空白對照)、B（空載質粒pIRES2/EGFP轉染陰性對照）、C（pIRES2/EGFP-uPA+pIRES2/EGFP共轉染）、D組（pIRES2/EGFP-VEGF165+pIRES2/EGFP共轉染）、E組（pIRES2/EGFP-VEGF165+pIRES2/EGFP-uPA共轉染）。通過MTT比色法檢測各組細胞轉染后增殖能力，描畫細胞生長曲線，實時熒光定量PCR（QPCR）檢測各組細胞uPA及VEGF165mRNA相對含量，Western blot檢測uPA及VEGF165的蛋白表達。 結果： 1. pIRES2/EGFP-uPA和鑒定pIRES2/EGFP-VEGF165：重組質粒作XhoI和SalI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見VEGF165條帶和uPA條帶，酶切條帶與聚合酶鏈反應產(chǎn)物電泳帶處于相同位置。DNA序列測定證實，目的基因插入片段方向正確，序列無突變。 2.轉染pIRES2/EGFP-uPA和pIRES2/EGFP-VEGF165，MTT檢測結果提示E組細胞增殖速率高于較A、C、B組，差異有顯著性（P0.05）; E組與D組比較，，差異無顯著性（P0.05）。QPCR提示E組uPA基因相對表達量高于A、B、D組，差異有顯著性（P0.05）;E組與C組比較，差異無顯著性（P0.05）；E組VEGF165基因相對表達量高于較A、B、C組，差異有顯著性（P0.05）；E組與D組比較，差異無顯著性（P0.05）。Western blot檢測表明C、E組uPA蛋白表達量高于A、B、D組，C、E組之間uPA蛋白表達未見明顯差異，D組uPA蛋白表達量高于A、B組，A、B組表達少量uPA；D、E組VEGF165蛋白表達量高于A、B、C組。 結論： 1.uPA和VEGF165單基因真核表達質粒共轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞后目的基因uPA和VEGF165有效表達，細胞增殖速率明顯加強； 2.在細胞內(nèi)上調VEGF165能促進uPA的表達； 3.本實驗為轉染VEGF165和uPA治療靜脈血栓性疾病的基因研究奠定前期理論基礎。
【關鍵詞】：血管內(nèi)皮生長因子 尿激酶型纖溶酶原激活物 細胞增殖
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料與方法12-24
• 2.1 實驗材料12-14
• 2.1.1 實驗標本及試劑12-13
• 2.1.2 實驗儀器及設備13-14
• 2.1.3 配置試劑14
• 2.2 實驗方法14-24
• 2.1.1 引物合成14-15
• 2.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的復蘇、培養(yǎng)及傳代15
• 2.2.3 VEGF165 和 uPA 基因真核表達質粒的構建15-18
• 2.2.4 含 VEGF165、uPA 重組質粒的菌液擴增18-19
• 2.2.5 重組質粒 DNA 的提取19
• 2.2.6 脂質體介導質粒轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞19-20
• 2.2.7 實時熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)目的基因VEGF165和uPAmRNA相對含量20-21
• 2.2.8 Western-Blot 技術測定 HUVECs 中 VEGF165 和uPA 的蛋白表達21-22
• 2.2.9 MTT 比色法檢測并繪制細胞生長曲線22-23
• 2.2.10 統(tǒng)計學方法23-24
• 第3章 結果24-32
• 3.1 重組質粒檢測結果24-25
• 3.1.1 PCR 酶切結果24
• 3.1.2 質檢測序結果24-25
• 3.2 轉染效果25-27
• 3.3 實時熒光定量 PCR 檢測結果27-29
• 3.4 Western-Blot 技術測定結果29-30
• 3.5 MTT 比色法檢測結果30-32
• 第4章 討論32-39
• 第5章 結論與展望39-40
• 5.1 結論39
• 5.2 展望39-40
• 致謝40-41
• 參考文獻41-44
• 攻讀學位期間的研究成果44-45
• 綜述45-52
• 參考文獻50-52

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 周為民,李曉強,吳允明;下肢深靜脈血栓形成治療研究進展[J];解剖與臨床;2002年03期

2 陳彥祥;喬衛(wèi)紅;劉棟良;李宗石;;陽離子脂質體的轉染機制及轉染效率影響因素[J];生物工程學報;2007年05期

3 周為民;宋濤;;MTRR A66G基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的關系[J];中國普通外科雜志;2010年12期

本文編號：709698