發(fā)布時(shí)間：2017-08-20 11:23

  本文關(guān)鍵詞：廣西巴馬小型豬動(dòng)脈粥樣硬化模型制作的初步研究

  更多相關(guān)文章： 廣西巴馬小型豬 動(dòng)脈粥樣硬化模型 單核細(xì)胞趨化蛋白-1 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 免疫組化 實(shí)時(shí)定量PCR

【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種由遺傳和環(huán)境共同作用所引起的動(dòng)脈血管疾病,是心腦血管疾病發(fā)病的基礎(chǔ)。其主要特征是血管內(nèi)膜增厚,管腔變狹窄,不穩(wěn)定的纖維帽破裂,形成急性血栓。動(dòng)脈粥樣硬化的致病機(jī)制尚不是很清楚,制作動(dòng)物模型研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制顯得尤為重要。小型豬在解剖學(xué),生理學(xué),血液和血液生化指標(biāo)以及疾病發(fā)生機(jī)理等方面與人極其相似,常被用于制作心腦血管疾病和糖尿病等方面的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)以廣西巴馬小型豬為實(shí)驗(yàn)材料,選取糖尿病模型豬10頭,常規(guī)條件飼養(yǎng)的3月齡和6月齡豬各10頭,分別作為實(shí)驗(yàn)組1,實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3,飼以高脂高膽固醇飼料；選取6月齡豬10頭作為對(duì)照組并按常規(guī)條件進(jìn)行飼養(yǎng)。 在飼喂高脂高膽固醇飼料三個(gè)月后,實(shí)驗(yàn)組1動(dòng)物出現(xiàn)高膽固醇血癥,動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index, AI)均大于4.0,血管切片顯示血管內(nèi)膜均出現(xiàn)不同程度的損傷,腹主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)明顯的內(nèi)膜增厚,纖維斑塊隆起,血管腔變窄；HE染色結(jié)果顯示病灶處平滑肌細(xì)胞排列疏松紊亂,并存在大量的炎癥細(xì)胞和泡沫細(xì)胞,伴隨有典型的膽固醇結(jié)晶和斑塊底部鈣化,最嚴(yán)重的可達(dá)V級(jí)病變。 實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)3組飼喂高脂高膽固醇飼料后,體重增加明顯,實(shí)驗(yàn)開始第5個(gè)月,實(shí)驗(yàn)組2有4頭豬AI值連續(xù)3個(gè)月超過3.8；實(shí)驗(yàn)組3實(shí)驗(yàn)開始第2個(gè)月和第3個(gè)月各有1頭豬AI值連續(xù)3個(gè)月超過3.8。實(shí)驗(yàn)組3飼喂3個(gè)月,6個(gè)月后各屠宰3頭,做血管組織切片,HE染色結(jié)果顯示已發(fā)病豬的血管內(nèi)膜損傷,有明顯的纖維斑塊隆起,中層平滑肌細(xì)胞紊亂,有散在的炎癥細(xì)胞和泡沫細(xì)胞,膽固醇結(jié)晶和鈣化不明顯,纖維病變可達(dá)Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)。 將建模成功的豬的切片與AI值做關(guān)聯(lián)分析,初步確定廣西巴馬小型豬AS模型成功建立的判定標(biāo)準(zhǔn)為：實(shí)驗(yàn)豬發(fā)生AS疾病時(shí),AI值應(yīng)持續(xù)3個(gè)月或3個(gè)月以上大于3.8。實(shí)驗(yàn)組1所有豬的AI值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于3.8,且持續(xù)3個(gè)月以上,表明都已患動(dòng)脈粥樣硬化疾�。粚�(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3發(fā)生AS疾病的豬分別有2和4頭。 克隆廣西巴馬小型豬單核細(xì)胞趨化蛋白-1基因編碼區(qū)全長,將克隆獲得的片段與NCBI上公布的豬的MCP-1序列比對(duì),沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。其長度為300bp,與人的同源性為84.4%,與兔和小鼠的同源性分別為82.1%和74.2%。廣西巴馬小型豬MCP-1基因保守的半胱氨酸位置和人的一致,推測(cè)與人的MCP-1可能有相同或相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 對(duì)實(shí)驗(yàn)組3和對(duì)照組的單核細(xì)胞趨化蛋白-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)量進(jìn)行研究。免疫組化結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組3中MCP-1蛋白,MMP-9蛋白和LOX-1蛋白均有強(qiáng)陽性表達(dá),對(duì)照組無表達(dá)或弱表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組3與對(duì)照組比較,MCP-1基因表達(dá)量隨時(shí)間延長而增高,頸動(dòng)脈處MCP-1基因表達(dá)量具有顯著性差異(p0.05)；但兩組小型豬的MMP-9基因表達(dá)水平差異不顯著(p0.05)。
【關(guān)鍵詞】：廣西巴馬小型豬 動(dòng)脈粥樣硬化模型 單核細(xì)胞趨化蛋白-1 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 免疫組化 實(shí)時(shí)定量PCR
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R543.5;R-332
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-20
• 1 動(dòng)脈粥樣硬化13-15
• 1.1 動(dòng)脈粥樣硬化簡介13
• 1.2 動(dòng)脈粥樣硬化易患部位13
• 1.3 動(dòng)脈粥樣硬化致病機(jī)理13-14
• 1.4 動(dòng)脈粥樣硬化致病因素14-15
• 2 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型研究的進(jìn)展15-16
• 3 動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的研究進(jìn)展16-19
• 3.1 單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)16-17
• 3.2 基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinases 9,MMP-9)17-19
• 4 本研究的目的和意義19-20
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究20-23
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 1.1 材料來源20
• 1.2 主要試劑與酶類20
• 1.3 抗體來源20-21
• 1.4 溶液試劑及培養(yǎng)基的配置21-22
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 實(shí)驗(yàn)一 廣西巴馬小型豬動(dòng)脈粥樣硬化模型的制作23-38
• 1. 方法23-25
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇23
• 1.2 動(dòng)脈粥樣硬化模型的制作23-24
• 1.3 血管組織切片的制作24-25
• 1.4 數(shù)據(jù)處理25
• 2. 結(jié)果25-35
• 2.1 體重變化25-26
• 2.2 血液生化指標(biāo)及AI值26-29
• 2.3 個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化病理切片及其與個(gè)體AI指數(shù)值的關(guān)聯(lián)分析29-35
• 3 討論35-38
• 實(shí)驗(yàn)二 廣西巴馬小型豬MCP-1的克隆及分析38-47
• 1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 2 實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 2.1 總RNA的提取38
• 2.2 反轉(zhuǎn)錄38-39
• 2.3 引物設(shè)計(jì)39-40
• 2.4 目的片段合成40
• 2.5 PCR產(chǎn)物純化回收40-41
• 2.6 目的片段與PMD-18T載體的連接41
• 2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌及陽性質(zhì)粒篩選41-42
• 2.8 廣西巴馬小型豬MCP-1蛋白預(yù)測(cè)42
• 3 結(jié)果與分析42-45
• 3.1 總RNA的提取42
• 3.2 MCP-1基因PCR擴(kuò)增電泳及菌液PCR電泳42-43
• 3.3 MCP-1基因目的片段測(cè)序結(jié)果43-44
• 3.4 廣西巴馬小型豬MCP-1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)44
• 3.5 廣西巴馬小型豬MCP-1蛋白預(yù)測(cè)44-45
• 4 討論45-47
• 實(shí)驗(yàn)三 廣西巴馬小型豬AS相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)47-65
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料47
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法47-51
• 2.1 免疫組化切片的制作47
• 2.2 免疫組化陽性率統(tǒng)計(jì)47-48
• 2.3 血管及肝臟組織RNA的提取48
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄48-49
• 2.5 引物設(shè)計(jì)與合成49
• 2.6 MMP-9,MCP-1和內(nèi)參18s的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立49-50
• 2.7 MMP-9基因和MCP-1基因相對(duì)表達(dá)量50
• 2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析50-51
• 3 結(jié)果51-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)組3和對(duì)照組免疫組化結(jié)果51-57
• 3.2 RNA完整性檢測(cè)57
• 3.3 MMP-9,MCP-1和18s基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立結(jié)果57-58
• 3.4 MCP-1和MMP-9的相對(duì)表達(dá)結(jié)果58-61
• 4 討論61-65
• 4.1 實(shí)驗(yàn)組3和對(duì)照組免疫組化61-62
• 4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR62
• 4.3 MCP-1與MMP-9基因表達(dá)分析62-65
• 結(jié)論65-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 致謝71-73
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 梁家充;郭亞芬;陳江偉;楊柳;蘭干球;;廣西巴馬小型豬PPARγ-2基因多態(tài)性與2型糖尿病易感性的相關(guān)性[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年19期

2 陳東;嚴(yán)激;;動(dòng)脈粥樣硬化中基質(zhì)金屬蛋白酶的研究進(jìn)展[J];安徽醫(yī)藥;2010年08期

3 王靜華;丁素菊;鄧本強(qiáng);吳濤;陳歡;張生生;焦炳華;;頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊CD40、MMP9的表達(dá)及意義[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年09期

4 袁進(jìn);顧為望;;小型豬作為人類疾病動(dòng)物模型在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年02期

5 張賀;王承利;王洋;陳克研;蘇鵬;孫倩;;小型豬動(dòng)物模型在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究應(yīng)用[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年07期

6 張運(yùn);;動(dòng)脈粥樣硬化研究的當(dāng)前問題[J];中國醫(yī)藥科學(xué);2012年01期

7 崔華,何作云;不同階段食餌性動(dòng)脈粥樣硬化兔血管壁核因子κB活化和單核細(xì)胞趨化蛋白1與蛋白激酶Cα表達(dá)的變化[J];中國動(dòng)脈硬化雜志;2002年04期

8 潘勇翔;梁麗萍;劉健翔;;基質(zhì)金屬蛋白酶9基因多態(tài)性與2型糖尿病頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性[J];中國動(dòng)脈硬化雜志;2008年09期

9 張麗;張穎冬;李繼民;張曉雷;;基質(zhì)金屬蛋白酶-9/C1562T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系[J];臨床神經(jīng)病學(xué)雜志;2008年06期

，

本文編號(hào)：706348