本文關鍵詞：廣西巴馬小型豬動脈粥樣硬化模型制作的初步研究

  更多相關文章： 廣西巴馬小型豬 動脈粥樣硬化模型 單核細胞趨化蛋白-1 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 免疫組化 實時定量PCR

【摘要】：動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種由遺傳和環(huán)境共同作用所引起的動脈血管疾病,是心腦血管疾病發(fā)病的基礎。其主要特征是血管內(nèi)膜增厚,管腔變狹窄,不穩(wěn)定的纖維帽破裂,形成急性血栓。動脈粥樣硬化的致病機制尚不是很清楚,制作動物模型研究其發(fā)生發(fā)展機制顯得尤為重要。小型豬在解剖學,生理學,血液和血液生化指標以及疾病發(fā)生機理等方面與人極其相似,常被用于制作心腦血管疾病和糖尿病等方面的動物模型。本實驗以廣西巴馬小型豬為實驗材料,選取糖尿病模型豬10頭,常規(guī)條件飼養(yǎng)的3月齡和6月齡豬各10頭,分別作為實驗組1,實驗組2和實驗組3,飼以高脂高膽固醇飼料；選取6月齡豬10頭作為對照組并按常規(guī)條件進行飼養(yǎng)。 在飼喂高脂高膽固醇飼料三個月后,實驗組1動物出現(xiàn)高膽固醇血癥,動脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index, AI)均大于4.0,血管切片顯示血管內(nèi)膜均出現(xiàn)不同程度的損傷,腹主動脈和冠狀動脈出現(xiàn)明顯的內(nèi)膜增厚,纖維斑塊隆起,血管腔變窄；HE染色結果顯示病灶處平滑肌細胞排列疏松紊亂,并存在大量的炎癥細胞和泡沫細胞,伴隨有典型的膽固醇結晶和斑塊底部鈣化,最嚴重的可達V級病變。 實驗組2和實驗3組飼喂高脂高膽固醇飼料后,體重增加明顯,實驗開始第5個月,實驗組2有4頭豬AI值連續(xù)3個月超過3.8；實驗組3實驗開始第2個月和第3個月各有1頭豬AI值連續(xù)3個月超過3.8。實驗組3飼喂3個月,6個月后各屠宰3頭,做血管組織切片,HE染色結果顯示已發(fā)病豬的血管內(nèi)膜損傷,有明顯的纖維斑塊隆起,中層平滑肌細胞紊亂,有散在的炎癥細胞和泡沫細胞,膽固醇結晶和鈣化不明顯,纖維病變可達Ⅱ級或Ⅲ級。 將建模成功的豬的切片與AI值做關聯(lián)分析,初步確定廣西巴馬小型豬AS模型成功建立的判定標準為：實驗豬發(fā)生AS疾病時,AI值應持續(xù)3個月或3個月以上大于3.8。實驗組1所有豬的AI值都遠遠高于3.8,且持續(xù)3個月以上,表明都已患動脈粥樣硬化疾��；實驗組2和實驗組3發(fā)生AS疾病的豬分別有2和4頭。 克隆廣西巴馬小型豬單核細胞趨化蛋白-1基因編碼區(qū)全長,將克隆獲得的片段與NCBI上公布的豬的MCP-1序列比對,沒有發(fā)現(xiàn)突變位點。其長度為300bp,與人的同源性為84.4%,與兔和小鼠的同源性分別為82.1%和74.2%。廣西巴馬小型豬MCP-1基因保守的半胱氨酸位置和人的一致,推測與人的MCP-1可能有相同或相似的二級結構。 對實驗組3和對照組的單核細胞趨化蛋白-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的轉錄水平和翻譯水平的表達量進行研究。免疫組化結果顯示,實驗組3中MCP-1蛋白,MMP-9蛋白和LOX-1蛋白均有強陽性表達,對照組無表達或弱表達。實時定量PCR結果顯示：實驗組3與對照組比較,MCP-1基因表達量隨時間延長而增高,頸動脈處MCP-1基因表達量具有顯著性差異(p0.05)；但兩組小型豬的MMP-9基因表達水平差異不顯著(p0.05)。
【關鍵詞】：廣西巴馬小型豬 動脈粥樣硬化模型 單核細胞趨化蛋白-1 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 免疫組化 實時定量PCR
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R543.5;R-332
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文獻綜述13-20
• 1 動脈粥樣硬化13-15
• 1.1 動脈粥樣硬化簡介13
• 1.2 動脈粥樣硬化易患部位13
• 1.3 動脈粥樣硬化致病機理13-14
• 1.4 動脈粥樣硬化致病因素14-15
• 2 動脈粥樣硬化動物模型研究的進展15-16
• 3 動脈粥樣硬化相關基因的研究進展16-19
• 3.1 單核細胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)16-17
• 3.2 基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinases 9,MMP-9)17-19
• 4 本研究的目的和意義19-20
• 第二章 實驗研究20-23
• 1. 實驗材料20-22
• 1.1 材料來源20
• 1.2 主要試劑與酶類20
• 1.3 抗體來源20-21
• 1.4 溶液試劑及培養(yǎng)基的配置21-22
• 2. 實驗儀器22-23
• 實驗一 廣西巴馬小型豬動脈粥樣硬化模型的制作23-38
• 1. 方法23-25
• 1.1 實驗動物的選擇23
• 1.2 動脈粥樣硬化模型的制作23-24
• 1.3 血管組織切片的制作24-25
• 1.4 數(shù)據(jù)處理25
• 2. 結果25-35
• 2.1 體重變化25-26
• 2.2 血液生化指標及AI值26-29
• 2.3 個體動脈粥樣硬化病理切片及其與個體AI指數(shù)值的關聯(lián)分析29-35
• 3 討論35-38
• 實驗二 廣西巴馬小型豬MCP-1的克隆及分析38-47
• 1 實驗材料38
• 2 實驗方法38-42
• 2.1 總RNA的提取38
• 2.2 反轉錄38-39
• 2.3 引物設計39-40
• 2.4 目的片段合成40
• 2.5 PCR產(chǎn)物純化回收40-41
• 2.6 目的片段與PMD-18T載體的連接41
• 2.7 重組質(zhì)粒轉化感受態(tài)細菌及陽性質(zhì)粒篩選41-42
• 2.8 廣西巴馬小型豬MCP-1蛋白預測42
• 3 結果與分析42-45
• 3.1 總RNA的提取42
• 3.2 MCP-1基因PCR擴增電泳及菌液PCR電泳42-43
• 3.3 MCP-1基因目的片段測序結果43-44
• 3.4 廣西巴馬小型豬MCP-1蛋白一級結構44
• 3.5 廣西巴馬小型豬MCP-1蛋白預測44-45
• 4 討論45-47
• 實驗三 廣西巴馬小型豬AS相關基因的表達檢測47-65
• 1. 實驗材料47
• 2. 實驗方法47-51
• 2.1 免疫組化切片的制作47
• 2.2 免疫組化陽性率統(tǒng)計47-48
• 2.3 血管及肝臟組織RNA的提取48
• 2.4 反轉錄48-49
• 2.5 引物設計與合成49
• 2.6 MMP-9,MCP-1和內(nèi)參18s的標準曲線的建立49-50
• 2.7 MMP-9基因和MCP-1基因相對表達量50
• 2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析50-51
• 3 結果51-61
• 3.1 實驗組3和對照組免疫組化結果51-57
• 3.2 RNA完整性檢測57
• 3.3 MMP-9,MCP-1和18s基因標準曲線的建立結果57-58
• 3.4 MCP-1和MMP-9的相對表達結果58-61
• 4 討論61-65
• 4.1 實驗組3和對照組免疫組化61-62
• 4.2 實時熒光定量PCR62
• 4.3 MCP-1與MMP-9基因表達分析62-65
• 結論65-67
• 參考文獻67-71
• 致謝71-73
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況73

【參考文獻】

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本文編號：706348