本文關(guān)鍵詞：人CD137和CD28蛋白表達(dá)及單克隆抗體制備

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【摘要】：目的：真核表達(dá)人CD137和CD28-免疫球蛋白融合蛋白,分別制備CD137和CD28單克隆抗體,為淋巴細(xì)胞活化及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 內(nèi)容：1.CD137/CD28真核表達(dá)載體的構(gòu)建；2.瞬時(shí)、穩(wěn)定表達(dá)CD137和CD28融合蛋白細(xì)胞株建立、蛋白制備及其鑒定；3.CD137和CD28單克隆抗體制備。 方法：淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞、經(jīng)過PHA體外刺激培養(yǎng)，收集細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增CD137及CD28胞外區(qū)全長(zhǎng)序列，構(gòu)建pD18Y-CD137和pD18Y-CD28的表達(dá)載體，同時(shí)構(gòu)建pCDH-CD137和pCDH-CD28的表達(dá)載體。利用Lipofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，經(jīng)ELISA和Western blot鑒定培養(yǎng)上清融合蛋白表達(dá)情況。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO/dhfr-，利用二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng)，以透析血清及甲氨蝶呤MTX加壓篩選分別獲得持續(xù)表達(dá)pD18Y-CD137-Ig、pD18Y-CD28-Ig工程株。采用雙抗夾心ELISA和免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)上述融合蛋白進(jìn)行定性和定量，流式檢測(cè)hIg-CD28表達(dá)蛋白活性，通過親和層析富集表達(dá)上清融合蛋白。采用常規(guī)免疫方法免疫BALB/c小鼠，進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。利用有限稀釋法和反復(fù)克隆獲取穩(wěn)定雜交瘤。 結(jié)果：順利實(shí)現(xiàn)了pCDH-CD137/CD28和pD18Y-CD137/CD28表達(dá)載體構(gòu)建；獲得了分別表達(dá)pD18Y-CD137/CD28-Ig和pCDH-CD137/CD28-Ig融合蛋白的轉(zhuǎn)染表達(dá)細(xì)胞株，瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)目的融合蛋白。體外活性分析證實(shí)hIg-CD28融合蛋白具有體外與天然配體結(jié)合活性，，與活化B淋巴細(xì)胞結(jié)合；經(jīng)過篩選和克隆，獲得了至少5株CD137單克隆抗體；CD28雜交瘤細(xì)胞株初篩出25株陽性克隆。 結(jié)論：真核系統(tǒng)成功表達(dá)人CD137和CD28免疫球蛋白融合蛋白，成功制備了CD137和CD28單克隆抗體，能夠與CD137和CD28蛋白高親和力結(jié)合，為后續(xù)相關(guān)基礎(chǔ)及應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人CD137 人CD28 融合蛋白表達(dá) 單克隆抗體制備
【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-10
• 第一部分 CD137 及 CD28 真核表達(dá)載體構(gòu)建10-23
• 材料和方法10-19
• 結(jié)果19-23
• 第二部分 融合蛋白的表達(dá)、鑒定23-42
• 材料和方法23-33
• 結(jié)果33-42
• 第三部分 CD137 和 CD28 特異性單克隆抗體制備42-55
• 材料和方法42-50
• 結(jié)果50-55
• 討論55-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 文獻(xiàn)綜述63-73
• 參考文獻(xiàn)70-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況73-74
• 致謝74-75
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷75

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：706543