本文關(guān)鍵詞：免疫磁珠分離技術(shù)用于弓形蟲速殖子純化的研究

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【摘要】：目的在弓形蟲和弓形蟲病的基礎(chǔ)和臨床研究中，以及免疫診斷的抗原制備中，如何從弓形蟲感染的宿主標(biāo)本中快速獲得高度純化的弓形蟲速殖子，盡可能去除宿主細(xì)胞成分的污染，又盡可能避免對(duì)蟲體產(chǎn)生機(jī)械或者化學(xué)的損傷，不影響其活性與毒力顯得尤為重要。目前使用的各種方法純化產(chǎn)物尚有不同程度的宿主細(xì)胞的污染，或者回收率較低。因此，需要探討一種新的純化弓形蟲速殖子的方法。用免疫磁珠分離技術(shù)分選弓形蟲速殖子，，以去除宿主細(xì)胞成分，并盡可能對(duì)蟲體的生物學(xué)特性無不良影響，為弓形蟲與弓形蟲病的基礎(chǔ)與臨床研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。 方法將采自流浪貓的心、腦、舌組織提取的弓形蟲Wh3株速殖子（基因型為China1）感染小鼠，發(fā)病后提取腹腔液，無菌生理鹽水離心洗滌三次后，常規(guī)方法制備速殖子可溶性抗原, BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定抗原濃度。免疫新西蘭大白兔共3次，獲得兔抗弓形蟲多克隆抗體IgG。用弓形蟲IHA間接血凝診斷試劑測(cè)定抗體效價(jià)，Protein A Sepharose CL-4B親和層析柱純化抗體后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定抗體的純度。用抗體包被的免疫磁珠Goat Anti-Rabbit IgG MicroBeads對(duì)小鼠腹腔液內(nèi)弓形蟲速殖子進(jìn)行純化，按照說明書操作并稍加改進(jìn)，比較速殖子純度、細(xì)胞清除率、蟲體回收率，并進(jìn)行染色鏡檢。用MTS細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行速殖子活性檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)各孔吸光度值。將速殖子懸液定量分組感染小鼠后，檢測(cè)其毒力與感染性。 結(jié)果BCA法測(cè)定抗原濃度為0.7mg/ml，純化后IgG抗體輕鏈和重鏈分子量在25ku和50ku。用免疫磁珠分離技術(shù)純化弓形蟲速殖子后，其純度提高到98.2%，弓形蟲速殖子與小鼠細(xì)胞數(shù)量之比為53.6:1，細(xì)胞清除率為96%，蟲體回收率為73.5%。磁珠分離前后速殖子及小鼠細(xì)胞瑞氏染色鏡檢，磁珠分離前腹腔液涂片可見速殖子和少量小鼠細(xì)胞，分離后懸液涂片可見大量速殖子，視野中小鼠細(xì)胞比例明顯減少。速殖子MTS細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒活性檢測(cè)為95.6%，磁珠分離前后速殖子活性檢測(cè)吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明磁珠分選對(duì)弓形蟲速殖子活性無明顯影響。定量分組感染小鼠后死亡時(shí)間無顯著性差異，死亡前均出現(xiàn)弓形蟲急性感染的臨床體征，腹水可見大量的弓形蟲速殖子和假包囊，說明磁珠分選對(duì)弓形蟲速殖子毒力無影響。 結(jié)論免疫磁珠分離后的速殖子純度、細(xì)胞清除率和蟲體回收率較高，能有效的去除宿主細(xì)胞，且對(duì)速殖子的活性和毒力無影響。分離后速殖子鏡檢形態(tài)典型完整。本法操作簡(jiǎn)便快速，無需昂貴的儀器設(shè)備，具有較大的實(shí)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 純化 速殖子 免疫磁珠分離
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R382.5
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-26
• 實(shí)驗(yàn)材料和試劑13-17
• 實(shí)驗(yàn)方法17-26
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理26
• 結(jié)果26-31
• 討論31-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-40
• 附錄一 個(gè)人簡(jiǎn)歷40-41
• 附錄二 致謝41-42
• 附錄三 綜述42-51
• 參考文獻(xiàn)48-51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號(hào)：704601