本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌ClpC2蛋白的表達及其特性探討

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【摘要】：目的 構(gòu)建MTB ClpC2基因原核表達質(zhì)粒，在大腸埃希菌（Escherichia.coli, E.coli）BL21中表達rClpC2蛋白；rClpC2蛋白經(jīng)親和層析法純化后免疫新西蘭大白兔，制備兔抗ClpC2多克隆抗體（anti-rClpC2抗血清）；間接ELISA法檢測肺結(jié)核病人血清中相應(yīng)的抗原、抗體，判斷rClpC2和anti-rClpC2抗血清分別作為檢測抗原或抗體的特異性和敏感性，，為結(jié)核病早期診斷提供實驗依據(jù)。在E.coli BL21中過表達重組蛋白，觀察E.coli BL21在各種應(yīng)激條件下的生長情況，為后續(xù)深入研究MTB ClpC2蛋白酶的生物學功能奠定實驗基礎(chǔ)。 方法 1.以MTB H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴增ClpC2基因，插入表達載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2并轉(zhuǎn)化E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，利用SDS-PAGE和Western-blot對表達產(chǎn)物進行鑒定。 2.純化后的rClpC2與等體積的弗氏佐劑充分混合，采用皮下多點注射法免疫新西蘭大白兔，于第五次免疫后的第七天采血，通過Western-blot檢測anti-rClpC2抗血清的特異性；雙向免疫擴散法和間接ELISA檢測anti-rClpC2抗血清的效價；rClpC2通過間接ELISA進行抗原性的初步檢測，anti-rClpC2抗血清通過間接ELISA檢測肺結(jié)核病人血清中ClpC2抗原，判斷rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗體分別作為檢測抗原或抗體的特異性和敏感性。 3.通過檢測各組菌液OD600觀察過表達ClpC2或ClpP1蛋白及共表達ClpP1和ClpC2蛋白的E.coli BL21的生長曲線及其在氧化應(yīng)激、酸應(yīng)激、堿應(yīng)激、乙醇應(yīng)激條件下的生長狀況；采用結(jié)晶紫半定量法檢測蛋白過表達對E.coli BL21生物膜形成的影響。 結(jié)果 1.重組原核表達質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2雙向測序結(jié)果顯示與ClpC2基因序列完全一致，表達的融合蛋白Trx-ClpC2相對分子質(zhì)量為46000，可與MTB H37Rv株免疫的小鼠血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。 2.純化的rClpC2純度約為88.5%，Western-blot驗證anti-rClpC2抗血清的特異性；ELISA測得anti-rClpC2抗血清的效價為1:320000，雙向免疫擴散法測得anti-rClpC2抗血清的效價為1:32；rClpC2在檢測肺結(jié)核病人中的相應(yīng)抗體檢出率為46%，檢測敏感性為46%，特異性為90%；anti-rClpC2抗血清在檢測肺結(jié)核病人中的相應(yīng)抗原檢出率為40%，檢測的敏感性為40%，特異性為90%。 3.過表達ClpP1蛋白的E.coli BL21對過氧化氫的耐受增加，共表達ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21的生長；共表達ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21抵抗酸應(yīng)激、堿應(yīng)激；重組蛋白的過表達并未對E.coli BL21生物膜的形成起促進作用。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2，并在E.coli BL21中表達ClpC2蛋白。 2.成功制備兔抗ClpC2多克隆抗體，并初步應(yīng)用于MTB感染的診斷。 3.ClpP1蛋白與E.coli抵抗氧化應(yīng)激有關(guān)；共表達ClpC2和ClpP1蛋白與E.coli抵抗酸應(yīng)激、堿應(yīng)激有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 ClpC2 抗血清 應(yīng)激反應(yīng)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 結(jié)核分枝桿菌 ClpC2 基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、表達及鑒定16-29
• 1 材料與方法16-24
• 2 實驗結(jié)果24-27
• 3 討論27-29
• 第二部分 結(jié)核分枝桿菌 ClpC2 蛋白的純化、抗血清的制備及抗原性分析29-38
• 1 材料與方法29-33
• 2 實驗結(jié)果33-36
• 3 討論36-38
• 第三部分 蛋白過表達對大腸桿菌的影響38-47
• 1 材料與方法38-41
• 2 實驗結(jié)果41-45
• 3 討論45-47
• 全文小結(jié)47-48
• 參考文獻48-53
• 文獻綜述53-63
• 參考文獻58-63
• 致謝63-64
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學位論文64-65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 牛欽王;李紅霞;曾林子;徐佳楠;陳建平;;結(jié)核分枝桿菌三種特異性抗體ELISA檢測方法的建立[J];熱帶醫(yī)學雜志;2010年10期

2 董江濤;徐芳;田璽擇;姚楠;吳芳;章樂;王遠志;曹旭東;張萬江;;不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染小鼠對肺泡巨噬細胞的凋亡率及其時相性變化的影響[J];中國免疫學雜志;2012年05期

本文編號：703480