本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌ClpC2蛋白的表達(dá)及其特性探討

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【摘要】：目的 構(gòu)建MTB ClpC2基因原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸埃希菌（Escherichia.coli, E.coli）BL21中表達(dá)rClpC2蛋白；rClpC2蛋白經(jīng)親和層析法純化后免疫新西蘭大白兔，制備兔抗ClpC2多克隆抗體（anti-rClpC2抗血清）；間接ELISA法檢測肺結(jié)核病人血清中相應(yīng)的抗原、抗體，判斷rClpC2和anti-rClpC2抗血清分別作為檢測抗原或抗體的特異性和敏感性，，為結(jié)核病早期診斷提供實(shí)驗依據(jù)。在E.coli BL21中過表達(dá)重組蛋白，觀察E.coli BL21在各種應(yīng)激條件下的生長情況，為后續(xù)深入研究MTB ClpC2蛋白酶的生物學(xué)功能奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。 方法 1.以MTB H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ClpC2基因，插入表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2并轉(zhuǎn)化E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western-blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 2.純化后的rClpC2與等體積的弗氏佐劑充分混合，采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔，于第五次免疫后的第七天采血，通過Western-blot檢測anti-rClpC2抗血清的特異性；雙向免疫擴(kuò)散法和間接ELISA檢測anti-rClpC2抗血清的效價；rClpC2通過間接ELISA進(jìn)行抗原性的初步檢測，anti-rClpC2抗血清通過間接ELISA檢測肺結(jié)核病人血清中ClpC2抗原，判斷rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗體分別作為檢測抗原或抗體的特異性和敏感性。 3.通過檢測各組菌液OD600觀察過表達(dá)ClpC2或ClpP1蛋白及共表達(dá)ClpP1和ClpC2蛋白的E.coli BL21的生長曲線及其在氧化應(yīng)激、酸應(yīng)激、堿應(yīng)激、乙醇應(yīng)激條件下的生長狀況；采用結(jié)晶紫半定量法檢測蛋白過表達(dá)對E.coli BL21生物膜形成的影響。 結(jié)果 1.重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2雙向測序結(jié)果顯示與ClpC2基因序列完全一致，表達(dá)的融合蛋白Trx-ClpC2相對分子質(zhì)量為46000，可與MTB H37Rv株免疫的小鼠血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。 2.純化的rClpC2純度約為88.5%，Western-blot驗證anti-rClpC2抗血清的特異性；ELISA測得anti-rClpC2抗血清的效價為1:320000，雙向免疫擴(kuò)散法測得anti-rClpC2抗血清的效價為1:32；rClpC2在檢測肺結(jié)核病人中的相應(yīng)抗體檢出率為46%，檢測敏感性為46%，特異性為90%；anti-rClpC2抗血清在檢測肺結(jié)核病人中的相應(yīng)抗原檢出率為40%，檢測的敏感性為40%，特異性為90%。 3.過表達(dá)ClpP1蛋白的E.coli BL21對過氧化氫的耐受增加，共表達(dá)ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21的生長；共表達(dá)ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21抵抗酸應(yīng)激、堿應(yīng)激；重組蛋白的過表達(dá)并未對E.coli BL21生物膜的形成起促進(jìn)作用。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2，并在E.coli BL21中表達(dá)ClpC2蛋白。 2.成功制備兔抗ClpC2多克隆抗體，并初步應(yīng)用于MTB感染的診斷。 3.ClpP1蛋白與E.coli抵抗氧化應(yīng)激有關(guān)；共表達(dá)ClpC2和ClpP1蛋白與E.coli抵抗酸應(yīng)激、堿應(yīng)激有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 ClpC2 抗血清 應(yīng)激反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 結(jié)核分枝桿菌 ClpC2 基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定16-29
• 1 材料與方法16-24
• 2 實(shí)驗結(jié)果24-27
• 3 討論27-29
• 第二部分 結(jié)核分枝桿菌 ClpC2 蛋白的純化、抗血清的制備及抗原性分析29-38
• 1 材料與方法29-33
• 2 實(shí)驗結(jié)果33-36
• 3 討論36-38
• 第三部分 蛋白過表達(dá)對大腸桿菌的影響38-47
• 1 材料與方法38-41
• 2 實(shí)驗結(jié)果41-45
• 3 討論45-47
• 全文小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 文獻(xiàn)綜述53-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 致謝63-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文64-65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 牛欽王;李紅霞;曾林子;徐佳楠;陳建平;;結(jié)核分枝桿菌三種特異性抗體ELISA檢測方法的建立[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2010年10期

2 董江濤;徐芳;田璽擇;姚楠;吳芳;章樂;王遠(yuǎn)志;曹旭東;張萬江;;不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染小鼠對肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡率及其時相性變化的影響[J];中國免疫學(xué)雜志;2012年05期

本文編號：703480