本文關鍵詞：GRIN2B shRNA的構建及其對小鼠NR2B基因沉默效果的實驗研究

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【摘要】：目的： 1.設計并構建小鼠NMDA受體NR2B亞基短發(fā)卡RNA干擾真核表達載體(GRIN2B shRNA)并鑒定。 2.通過鞘內(nèi)轉染聚乙烯亞胺(PEI)介導的GRIN2B shRNA干擾質(zhì)粒,研究該干擾質(zhì)粒對小鼠NR2B基因表達的影響,探討GRIN2B shRNA干擾質(zhì)粒用于慢性疼痛治療的可行性。 方法： 1.根據(jù)NMDA受體NR2B亞基mRNA編碼序列,設計并合成針對NR2B亞基的特異性RNA干涉片斷,將其克隆入pYr-1.1質(zhì)粒載體,構建NR2B亞基shRNA真核表達載體pYr-1.1-GRIN2B-shRNA,并對其進行酶切和測序鑒定。 2.選用成年雄性C57BL/6小鼠60只,隨機分為4組：正常組、生理鹽水組、陰性對照組和PEI-shRNA組。于鞘內(nèi)注射后第7天在小鼠足底皮下注射50μL1%的福爾馬林后對其進行疼痛行為學觀察,并且取小鼠腰段脊髓分別行RT-PCR、Western Blot檢測及免疫組化分析,觀察小鼠脊髓NR2B mRNA、蛋白的表達水平及定位。 結果： 1.酶切和測序結果均證明NMDA受體NR2B亞基短發(fā)卡RNA已經(jīng)插入到質(zhì)粒載體pYr-1.1里。 2.疼痛行為學觀察顯示：福爾馬林所致的Ⅰ相期(急性期)的傷害性反應,在各組中均無差別(p0.05)；與正常組、生理鹽水(NS)組、陰性對照(Scr)組相比,PEI-shRNA組Ⅱ相期(強直期)的傷害性反應顯著減少(p0.05),而正常組、生理鹽水組和陰性對照組比較,無顯著性差異(p0.05)。 3.PCR及Western Blot檢測小鼠脊髓NR2B mRNA及蛋白的表達顯示：與正常組、NS組和Scr組相比,PEI-shRNA組小鼠L4-6段脊髓的NR2B mRNA及蛋白表達水平明顯降低(p0.05),而正常組、生NS組和Scr組比較,無顯著性差異(p0.05)。 4.免疫組化結果顯示：NR2B主要在小鼠L4-6段脊髓背角淺層表達；與正常組、NS組和Scr組相比,PEI-shRNA組小鼠L4-6段脊髓NR2B陽性的細胞數(shù)明顯減少(p0.05),而正常組、NS組和Scr組比較,無顯著性差異(p0.05)。 結論： 1. pYr-1.1-GRIN2B-shRNA干擾質(zhì)粒構建成功,為后續(xù)NR2B作為鎮(zhèn)痛靶點的基因治療奠定了基礎。 2.PEI介導的GRIN2B shRNA干擾質(zhì)粒能夠使小鼠脊髓NR2B的表達明顯下調(diào)。 3.PEI介導的GRIN2B shRNA干擾質(zhì)粒能夠減輕福爾馬林引起的Ⅱ相炎性痛,進一步證明NR2B在疼痛的維持與中樞敏化中起重要作用,為疼痛治療提供了新的方法和思路。
【關鍵詞】：NR2B RNAi 短發(fā)卡RNA 疼痛
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 符號說明10-12
• 1 前言12-14
• 2 小鼠GRIN2B shRNA干擾質(zhì)粒的構建、抽提及鑒定14-26
• 2.1 材料與方法14-19
• 2.1.1 實驗材料14-15
• 2.1.2 實驗方法15-19
• 2.2 結果19-22
• 2.2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結果19-20
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的測序分析結果20
• 2.2.3 質(zhì)粒DNA的濃度及純度的測定結果20-21
• 2.2.4 pYr-1.1質(zhì)粒及pYr-1.1-GRIN2B-shRNA質(zhì)粒圖譜21-22
• 2.3 討論22-25
• 2.3.1 siRNA作用位點的選擇22-23
• 2.3.2 siRNA的起始堿基與序列長度的選擇23
• 2.3.3 siRNA序列中GC含量的選擇23
• 2.3.4 siRNA序列3’端堿基的選取原則23-24
• 2.3.5 siRNA啟動子的選擇24
• 2.3.6 siRNA的合成24-25
• 2.4 結論25-26
• 3 鞘內(nèi)注射GRIN2B shRNA對小鼠NR2B基因表達的影響26-40
• 3.1 材料與方法26-35
• 3.1.1 實驗材料26-28
• 3.1.2 實驗方法28-35
• 3.2 結果35-37
• 3.2.1 PEI-GRIN2B-shRNA復合物鞘內(nèi)注射減輕小鼠福爾馬林所致的Ⅱ相疼痛反應35-36
• 3.2.2 逆轉錄PCR檢測L4-6段脊髓NR2B的表達36
• 3.2.3 Western Blot檢測L4-6段脊髓NR2B的表達36-37
• 3.2.4 免疫組化檢測L4-6段脊髓NR2B的表達37
• 3.3 討論37-39
• 3.4 結論39-40
• 參考文獻40-43
• 綜述43-53
• 參考文獻48-53
• 在讀期間發(fā)表論文情況53-54
• 致謝54

【參考文獻】

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本文編號：703501