本文關(guān)鍵詞：新型核酸檢測系統(tǒng)用于高通量診斷多種呼吸道病毒的研究

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【摘要】：研究背景與目的：呼吸道感染是世界范圍的常見病,主要是由呼吸道病毒及一些細(xì)菌、支原體、衣原體等引起。病毒中最常見的是流感病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒等,通常會引起嬰幼兒、老人及免疫受損病人嚴(yán)重的上下呼吸道感染,導(dǎo)致哮喘、細(xì)支氣管炎、肺炎等,而且極易引起流行或爆發(fā),具有很高的發(fā)病率和死亡率。其臨床表現(xiàn)相似,這給及時、準(zhǔn)確地診斷呼吸道傳染病、控制疫情帶來很大的挑戰(zhàn)。 目前,很多病毒學(xué)診斷實驗室聯(lián)合使用病毒培養(yǎng)、免疫熒光染色以及分子診斷方法來檢測呼吸道病毒。但是病毒培養(yǎng)周期長,對實驗室條件要求高；免疫熒光染色的靈敏度及抗血清的可獲性是其主要限制因素；分子診斷方法,最常用的是核酸檢測,由于其要求提取樣本核酸,并對核酸進行逆轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記或擴增等步驟,操作復(fù)雜,誤差較大,很難高通量進行。本課題旨在建立一種簡單、靈敏、特異而且準(zhǔn)確穩(wěn)定的大規(guī)模高通量多病原檢測方法,適用于大規(guī)模的呼吸道病毒的篩查和流行病學(xué)調(diào)查研究。 研究方法：我們直接以病毒RNA作為檢測靶標(biāo),通過簡單樣本裂解釋放RNA,利用以微球為基礎(chǔ)的高通量xMAP技術(shù)捕獲靶標(biāo)RNA：然后聯(lián)合應(yīng)用線性oligo DNA分子放大信號方式,對同一個樣本同時進行11種呼吸道病毒指標(biāo)的檢測,包括甲、乙型流感病毒(fluA/fluB),甲、乙型呼吸道合胞病毒(RSVA/RSVB)、偏肺病毒(MPV),冠狀病毒229E/HKU,1、2、3型副流感病毒(piv1/piv2/piv3)、甲型鼻病毒(HRVA)。首先,我們根據(jù)11種靶標(biāo)病毒的特異保守區(qū)段分別設(shè)計一套探針和引物；然后對從北京疾控中心取回的11種常見呼吸道病毒核酸進行RT-PCR/PCR擴增,克隆得到質(zhì)粒,測序正確后進行轉(zhuǎn)錄,得到序列和濃度已知的靶標(biāo)RNA,4倍系列梯度稀釋,摸索最優(yōu)反應(yīng)條件,評價所建立方法的敏感性和特異性。最終確定最優(yōu)實驗條件,并對2006-2010年采集的180例咽拭子樣本進行檢測,檢測結(jié)果與RT-PCR方法比較。 研究結(jié)果：成功獲得11種病毒的靶標(biāo)RNA,并確定了最優(yōu)的反應(yīng)條件。IVT-RNA實驗表明本方法可以正確區(qū)分11種常見呼吸道病毒,彼此之間無交叉反應(yīng)；檢測下限均低于或等于4695個RNA拷貝。180例咽拭子樣本中,高通量方法與RT-PCR方法均為陽性的樣本為102例,另外有20例僅RT-PCR方法檢測陽性。統(tǒng)計學(xué)分析兩種檢測方法檢出率無顯著差異(P--0.22)。 研究結(jié)論本研究成功建立了可靠、靈敏、操作簡便、高通量的多種呼吸道病毒并行檢測方法,適用于大樣本量呼吸道病毒檢測,為呼吸道疾病監(jiān)控和流行病學(xué)研究提供有力工具。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道病毒 體外轉(zhuǎn)錄RNA 高通量 信號放大
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373.1;R440
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文縮略語7-8
• 第一章 綜述8-19
• 1. 呼吸道病毒介紹8-10
• 2. 呼吸道病毒檢測技術(shù)介紹10-15
• 3. 本研究的主要內(nèi)容和意義15-19
• 第二章 材料與方法19-31
• 一.實驗材料19-20
• 二.實驗方法20-31
• 1. 技術(shù)路線與實驗方法20-21
• 2. 樣本制備21-28
• 3 檢測流程28-30
• 4 檢測系統(tǒng)特異性評價30
• 5 檢測系統(tǒng)靈敏度評價30
• 6 咽拭子樣本檢測30
• 7 統(tǒng)計學(xué)方法30-31
• 第三章 實驗結(jié)果31-40
• 第四章 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-49
• 附錄49-55
• 致謝55-56
• 個人簡歷56-57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：687312