本文關(guān)鍵詞：局部RAS介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞VEGF分泌及體外血管生成

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【摘要】：第一部分局部RAS對缺氧誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 背景：間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種具有多向分化潛能、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點的干細(xì)胞，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。MSCs可用于治療多種血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病、肝硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。缺血性心臟病在世界范圍內(nèi)的致死率高居不下，其特點是心肌細(xì)胞的凋亡、心室重構(gòu)、最終導(dǎo)致心力衰竭。由于MSCs易于提取分離和體外擴(kuò)增、具有潛在的分化為心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力、能夠旁分泌生長因子，已成為治療缺血性心臟病的研究熱點。眾多的研究已表明在心肌梗死后移植MSCs可減輕心室重構(gòu)，增加梗死部位的血管密度，從而顯著的提高心功能。但是移植后MSCs的低存活率限制了其治療效率，絕大多數(shù)MSCs在移植后數(shù)天內(nèi)即已凋亡。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensinsystem, RAS）包括腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、血管緊張素II （AngII）等，RAS既存在于循環(huán)系統(tǒng)中，也存在于血管壁、心臟、中樞、腎臟等局部組織中，，共同參與對靶器官的調(diào)節(jié)。在MSCs中也存在RAS系統(tǒng)，其生理功能和病理變化尚未明晰。我們曾發(fā)現(xiàn)外源性的AngII可以通過AT1受體誘導(dǎo)MSCs分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。由于VEGF可通過提高細(xì)胞存活和血管生成能力介導(dǎo)MSCs在梗死心臟內(nèi)的保護(hù)作用，因此提高VEGF的表達(dá)與生成具有意義。已知缺氧是一種誘導(dǎo)MSCs分泌VEGF的方法，而缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)是通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）介導(dǎo)，HIF-1α的表達(dá)又可以通過Akt和ERK通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。但是缺氧是否會引起MSCs內(nèi)RAS表達(dá)改變，以及改變局部RAS是否影響缺氧誘導(dǎo)的VEGF的表達(dá)均未見報道。 目的：探討缺氧后MSCs內(nèi)部RAS的變化及其對缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)的影響 及其機(jī)制。 方法：第三代MSCs缺氧24h后，用Real-time PCR方法檢測MSCs內(nèi)AT1、AT2、ACE的表達(dá)；放射免疫的方法檢測缺氧后培養(yǎng)基中的AngⅡ的濃度；應(yīng)用血管緊張素1型受體(AT1)拮抗劑氯沙坦(losartan)、血管緊張素2型受體（AT2）拮抗劑PD123319進(jìn)行干預(yù)觀察兩者對缺氧誘導(dǎo)MSCs VEGF表達(dá)的影響，同時觀察兩者對Akt和ERK1/2磷酸化水平及HIF-1α表達(dá)水平的影響；用Akt特異性抑制劑LY294002和ERK特異性抑制劑U0126進(jìn)行干預(yù)觀察兩者對HIF-1α表達(dá)水平和缺氧誘導(dǎo)MSCs VEGF表達(dá)的影響。 結(jié)果：缺氧24小時后MSCs內(nèi)AT1、AT2、ACE表達(dá)水平較對照組均顯著升高，AngⅡ的分泌也同樣顯著增高；losartan抑制了缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α及VEGF表達(dá)水平、Akt和ERK1/2的磷酸化水平；LY294002及U0126抑制了缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α及VEGF表達(dá)水平。 結(jié)論：缺氧后MSCs內(nèi)部RAS表達(dá)水平增高，增高的AngⅡ通過AT1受體及下游的Akt、ERK及HIF-1α通路調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。 第二部分局部RAS對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外血管生成能力的影響 背景：缺血性心臟病如心肌梗死的特征主要是不可逆的心肌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞移植近年來被認(rèn)為是一種有效治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的干細(xì)胞，具有多分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下可以分化為心肌、脂肪、骨、內(nèi)皮等細(xì)胞。許多的研究報道MSCs移植可以降低缺血心臟的梗死面積，增加血管密度，增加射血分?jǐn)?shù)等。MSCs在治療心肌梗死時主要的機(jī)制有向心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化，旁分泌等，這些機(jī)制在MSCs移植后可同時存在。 盡管研究者們志在努力提高M(jìn)SCs向心肌細(xì)胞的分化率，但截至目前MSCs仍不能完全分化為成熟的心肌細(xì)胞，只是分化為表達(dá)一定心肌特異性基因的心肌樣細(xì)胞。在這種情況下，促進(jìn)新生血管形成可能在MSCs的治療作用中起主要作用。MSCs的新生血管作用來源于向內(nèi)皮細(xì)胞分化和旁分泌生長因子。MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的方法包括與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)、辛伐他汀、VEGF誘導(dǎo)等，其中以內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中加入VEGF和/或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)進(jìn)行定向誘導(dǎo)較為常用。另外，有研究指出血清剝奪MSCs長期培養(yǎng)后可以表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)識物，且具有較強的血管生成能力。而大鼠骨髓MSCs在正常培養(yǎng)條件下能否自發(fā)表現(xiàn)出一定的血管生成能力，局部RAS能否調(diào)節(jié)這種血管生成能力還未見報道。 目的：探討MSCs在正常培養(yǎng)過程中血管生成能力的變化及局部RAS對BMSCs血管生成能力的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs，分第3代對照、第7代對照、AngII、AngII+losartan、AngII+PD123319組進(jìn)行實驗。用Real-time PCR、體外血管生成試劑盒（Matrigel）及免疫熒光染色方法檢測各組細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)識物表達(dá)水平及血管生成能力。 結(jié)果：1.在培養(yǎng)至第7代后，正常培養(yǎng)的MSCs部分在形態(tài)上呈橢圓形；2.正常培養(yǎng)的第7代細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)識物的表達(dá)水平及血管生成能力明顯高于第3代細(xì)胞；3. AngII不能增加MSCs的血管生成能力；AngII+losartan可顯著降低MSCs的血管生成能力；AngII+PD123319則顯著增加了MSCs的血管生成能力。 結(jié)論：MSCs在體外正常培養(yǎng)條件下會自發(fā)的表達(dá)部分內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)識物，表現(xiàn)出一定的血管生成能力；局部RAS可以調(diào)節(jié)MSCs的血管生成能力。
【關(guān)鍵詞】：局部RAS MSCs 缺氧 VEGF Akt ERK 局部RAS MSCs 內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)識物 血管生成
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 第一部分 局部 RAS 對缺氧誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 VEGF 表達(dá)的影響12-37
• 1 引言12-16
• 2 材料和方法16-22
• 3 結(jié)果22-28
• 4 討論28-30
• 參考文獻(xiàn)30-37
• 第二部分 局部 RAS 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞血管生成能力的影響37-53
• 1 引言37-38
• 2 材料和方法38-43
• 3 結(jié)果43-47
• 4 討論47-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 綜述53-70
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 附錄70-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章情況71-72
• 致謝72

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本文編號：682214