本文關(guān)鍵詞：抑制陰道加德納菌的乳酸菌的篩選及其生物學(xué)特性

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【摘要】：健康女性陰道是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),定植著各種細(xì)菌,包括益生菌和條件致病菌,兩者處于平衡狀態(tài)。但在某些因素作用下,如雌激素水平的降低、性行為、抗生素的使用等,導(dǎo)致陰道內(nèi)一些條件致病菌如陰道加德納菌(Gardnerella vaginalis,G.v)過度生長,占優(yōu)勢地位的乳桿菌數(shù)量下降,引起菌群失衡,導(dǎo)致陰道疾病感染。其中,細(xì)菌性陰道炎(Bacterial vaginosis, BV)是女性最常見的陰道感染疾病之一,傳統(tǒng)治療法是使用甲硝唑和克林霉素,雖然可以有效消除致病菌,但常導(dǎo)致BV復(fù)發(fā)率偏高,且增強(qiáng)了一些致病菌的耐藥性。綜上,迫切需要尋找一種微生態(tài)療法,促使陰道微生態(tài)平衡恢復(fù)正常。大量研究和應(yīng)用實(shí)例已經(jīng)表明,利用乳桿菌治療BV是一種可行,高效,且有著廣闊發(fā)展空間的方法,目前國外學(xué)者已經(jīng)分離出幾株對陰道加德納菌有抑制作用的乳桿菌,而國內(nèi)陰道乳桿菌活菌制劑(商品名：定君生)僅有一種,即德式乳桿菌DM8909,為豐富候選菌株的多樣性,因此迫切需要尋找可作為治療細(xì)菌性陰道炎候選菌的乳酸桿菌。 本研究的主要目的是從健康育齡女性的陰道分泌物中分離對陰道加德納菌具有抑制作用的乳桿菌,并分析這些乳桿菌的生物學(xué)性質(zhì)。研究內(nèi)容包括：乳桿菌的分離與鑒定,對陰道加德納菌具有抑制作用菌株的篩選,篩選菌株對其他常見致病菌的抑菌作用,乳桿菌抑菌物質(zhì)的初步分析,篩選菌株對Hela細(xì)胞的粘附分析以及拮抗陰道加德納菌粘附Hela細(xì)胞的機(jī)制研究,最后評價了具有應(yīng)用潛力菌株的安全性。 研究結(jié)果表明：分離得到的18株乳桿菌均具有抑菌活性,其中3號、N7號、15號菌對病原指示菌的抗菌活性最高,對照組MRS中G.v菌落數(shù)的1g值為7.26,加入上述3株菌的無細(xì)胞上清液后G.v菌落數(shù)的1g值分別為5.09、5.42、5.44,加入商業(yè)對照菌株DM8909無細(xì)胞上清液后G.v菌落數(shù)的1g值為5.95。經(jīng)SPSS數(shù)據(jù)軟件分析得出3株菌的抑菌活性顯著高于德式乳桿菌DM8909(p0.05)。并且3株乳桿菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌也具有明顯的抑制作用。將4株菌無細(xì)胞上清液pH值調(diào)至7.0后,指示菌G.v菌落數(shù)變化不大,其1g值基本均在7.5-7.6之間,與對照組差異不顯著(p0.05),乳桿菌的抗菌活性基本消失,幾乎無抑菌活性。由此表明發(fā)酵上清液中的有機(jī)酸起到了主要抑菌作用。結(jié)合糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果和16S rDNA序列分析,3號、N7號、15號菌均鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。通過對4株菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究,初步掌握了其生長特性,并測定了其產(chǎn)酸和產(chǎn)H202能力以及在低酸環(huán)境中的耐受性。結(jié)果顯示3株植物乳桿菌發(fā)酵24h后的pH值皆在3.50左右,商業(yè)對照菌株DM8909的pH值為3.95,說明分離株具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力。其次,檢測了乳桿菌產(chǎn)H202能力,4株乳桿菌均產(chǎn)H202,但含量偏低。酸的耐受性實(shí)驗(yàn)中,3株植物乳桿菌在pH3.0培養(yǎng)8h后存活率均高達(dá)70%左右,結(jié)果表明分離株可以在陰道酸環(huán)境中較好存活。 經(jīng)過上述試驗(yàn)結(jié)果,選取3號、N7號和15號菌株為研究對象,采用與人體陰道上皮細(xì)胞最相似的Hela細(xì)胞作為粘附模型,測定了3株分離株和商業(yè)菌株德式乳桿菌DM8909對Hela細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株乳桿菌對Hela細(xì)胞均有較高的粘附能力。進(jìn)而對乳桿菌拮抗G.v對HeLa細(xì)胞粘附機(jī)制進(jìn)行了初步研究,比較了乳桿菌的排除、競爭、取代3種不同作用方式對G.v粘附HeLa細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明無論哪種方式下,與對照組相比,乳桿菌對G.v粘附HeLa細(xì)胞均具有明顯抑制作用,差異顯著,但4株乳桿菌之間的拮抗能力無異。3種不同作用方式發(fā)現(xiàn)排除作用方式抑制G.v粘附HeLa細(xì)胞作用效果較好,而取代實(shí)驗(yàn)組中乳桿菌的抑制能力最弱。 最后對分離株進(jìn)行了部分安全性試驗(yàn),抗敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離株對多數(shù)抗生素敏感,對克林霉素、萬古霉素、鏈霉素耐藥。溶血性試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離株均不溶血,即γ溶血,對人體無致病性。 本研究獲得的3株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)是正常婦女陰道的原籍菌,具有較強(qiáng)產(chǎn)酸、產(chǎn)H202及較強(qiáng)的抑菌作用,且抑菌效果顯著高于商業(yè)菌株德式乳桿菌DM8909。并且體外細(xì)胞粘附試驗(yàn)表明,3株植物乳桿菌具有較強(qiáng)的粘附Hela細(xì)胞能力,可以作為治療細(xì)菌性陰道炎(Bacterial vaginosis)的候選菌株進(jìn)行深入研究。
【關(guān)鍵詞】：乳桿菌 陰道加德納菌 抑菌作用 粘附
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-24
• 1.1 立題背景12
• 1.2 細(xì)菌性陰道炎12-14
• 1.3 利用乳酸桿菌對BV致病菌進(jìn)行控制的理論依據(jù)14-20
• 1.3.1 陰道微生態(tài)14-16
• 1.3.2 乳桿菌作為陰道優(yōu)勢菌群的抑菌機(jī)制16-20
• 1.4 治療細(xì)菌性陰道炎的現(xiàn)狀20-22
• 1.5 本研究的目的及意義22-23
• 1.6 本研究的技術(shù)路線23-24
• 2 材料與方法24-35
• 2.1 試驗(yàn)材料24-28
• 2.1.1 供試菌株24
• 2.1.2 細(xì)胞株24
• 2.1.3 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.4 主要溶液的配制25-26
• 2.1.5 主要試劑及來源26-27
• 2.1.6 主要儀器與設(shè)備27-28
• 2.2 試驗(yàn)方法28-35
• 2.2.1 乳酸桿菌的分離純化及培養(yǎng)28
• 2.2.2 乳桿菌屬水平上的鑒定28-29
• 2.2.3 對陰道加德納菌具有抑菌活性乳桿菌菌株的篩選29
• 2.2.4 具有抑菌活性乳桿菌的進(jìn)一步鑒定29-31
• 2.2.5 乳桿菌培養(yǎng)上清pH對抑菌活性的影響31
• 2.2.6 篩選獲得的乳桿菌對其它常見致病菌的抑菌活性31
• 2.2.7 篩選獲得的乳桿菌生物學(xué)性質(zhì)分析31-32
• 2.2.8 乳桿菌粘附Hela細(xì)胞能力的檢測32-34
• 2.2.9 分離菌株安全性評價34
• 2.2.10 數(shù)據(jù)分析與處理34-35
• 3 結(jié)果與分析35-50
• 3.1 乳酸桿菌的分離純化及初步鑒定35-37
• 3.1.1 疑似菌株的分離純化35-36
• 3.1.2 分離株的生理生化試驗(yàn)36-37
• 3.2 對陰道加德納菌具有抑菌活性乳桿菌菌株的篩選37-38
• 3.3 篩選獲得菌株在種水平上的鑒定38-41
• 3.3.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果38-39
• 3.3.2 菌株的16S rDNA序列同源性分析39-41
• 3.4 乳桿菌發(fā)酵上清pH對抑菌活性的影響41-42
• 3.5 篩選獲得的乳桿菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性42
• 3.6 篩選獲得的乳桿菌的生物學(xué)特性42-47
• 3.6.1 菌株的生長曲線42-43
• 3.6.2 菌株發(fā)酵液的pH曲線43-44
• 3.6.3 菌株產(chǎn)過氧化氫能力的測定44
• 3.6.4 菌株對酸的耐受性44-47
• 3.7 乳桿菌對Hela細(xì)胞的粘附47-49
• 3.7.1 Hela細(xì)胞的復(fù)蘇47
• 3.7.2 直接鏡檢法測定乳酸桿菌對Hela細(xì)胞的粘附能力47
• 3.7.3 平板菌落計(jì)數(shù)法測定乳酸桿菌對Hela細(xì)胞的粘附能力47-48
• 3.7.4 乳桿菌拮抗G.v粘附Hela細(xì)胞的機(jī)制48-49
• 3.8 安全性評價49-50
• 3.8.1 乳桿菌對抗生素的敏感性49
• 3.8.2 乳桿菌溶血性試驗(yàn)49-50
• 4 討論50-56
• 4.1 健康婦女陰道的菌群50
• 4.2 抑制陰道加德納菌的乳桿菌50-51
• 4.3 分離菌株鑒定方法51-52
• 4.4 抑菌活性物質(zhì)的初步分析52
• 4.5 理想活菌制劑應(yīng)具備的益生特性52-53
• 4.5.1 乳桿菌發(fā)酵pH值52-53
• 4.5.2 乳桿菌產(chǎn)過氧化氫的能力53
• 4.5.3 乳桿菌的酸耐受性53
• 4.6 體外Hela細(xì)胞粘附機(jī)制的分析53-54
• 4.7 安全性評價54-56
• 5 結(jié)論56-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 附錄65-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文75

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：682334