本文關鍵詞：花生過敏重組乳酸菌口服疫苗的制備及其效果的評價

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【摘要】：花生過敏是一種常見的食物過敏，具有發(fā)病率高、臨床癥狀嚴重和危險性高的特點，不易產生免疫耐受。目前避免接觸含有花生過敏原的食物是防治花生過敏的唯一途徑，因此尋求一種安全有效的預防花生過敏的方法具有重要意義。乳酸菌被公認為是安全的食品級微生物，部分菌株防治過敏性疾病的作用已獲得了肯定，利用乳酸菌表達各種抗原以制備口服疫苗的研究日益受到人們的關注。本文以乳酸菌作為宿主菌株表達花生過敏原Ara h2.02，旨在研究探索一種安全、有效、方便的新型花生過敏口服疫苗。 本文首先通過小鼠模型，研究干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Zhang）在抗花生過敏方面的作用。動物實驗結果表明，口服L. casei Zhang進行預防或治療處理后，小鼠花生過敏癥狀顯著減輕，血清中總IgE、特異性IgE和MCP-1的水平明顯降低，糞便中組胺的含量下降，而血清特異性IgG2a和黏膜總IgA水平有所上升。體外細胞刺激實驗表明，L. casei Zhang能顯著降低Th2細胞的反應，減少IL-4的分泌，而對IL-12以及IFN-γ的表達水平并沒有明顯的影響，但IFN-γ/IL-4的比例顯著增加。這些結果表明，L. casei Zhang能促使Th2優(yōu)勢反應向Th1反應轉變，具有明顯的免疫調節(jié)功能，從而起到預防和治療花生過敏反應的作用。 為了得到純化的Ara h2.02蛋白及anti-Ara h2.02多克隆抗體用于后續(xù)Western blot實驗，本研究構建含有密碼子優(yōu)化的nAra h2.02基因的大腸桿菌（Escherichia coli）表達載體pET-nh2，并轉化E. coli BL21（DE3），以IPTG誘導表達。表達的His-Ara h2.02蛋白經鎳柱親和層析純化后，目的蛋白純度為85%，將其用于免疫兔子得到效價為1:50000的多克隆抗體。 為降低天然過敏原在免疫治療中誘發(fā)過敏反應的風險，本文對nAra h2.02基因進行了序列重排及定點突變，得到低過敏原性的mAra h2.02基因。采用L. casei Zhang作為宿主菌株構建口服疫苗，但結果表明nAra h2.02和mAra h2.02基因在L. casei Zhang中表達不成功。而乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作為乳酸菌的模式菌，常被用作宿主菌株表達外源蛋白。因此選擇L. lactis NZ9000作為宿主菌株，重新構建花生過敏口服疫苗。將乳酸乳球菌表達載體pNZ-nh2和pNZ-mh2電擊轉化L. lactis NZ9000后，成功地誘導表達了目標蛋白。通過動物實驗評價該口服疫苗，結果顯示，重組乳酸菌口服疫苗能顯著減輕小鼠花生過敏的癥狀，抑制小鼠體內Th2型過敏反應（總IgE、特異性IgE抗體、MCP-1、組胺以及IL-4細胞因子），，增加Th1型特異性IgG2a抗體水平，同時上調IFN-γ/IL-4的比例。這些結果表明，重組乳酸菌花生過敏口服疫苗，尤其是低過敏原性的重組菌，能抑制Th2反應，同時促進Th1反應，從而預防花生過敏。 綜上所述，本研究成功構建了一種安全、有效的花生過敏口服疫苗，為花生過敏的預防提供了新的思路和方法。
【關鍵詞】：乳酸菌 花生過敏 口服疫苗 重組表達
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 前言9-17
• 1.1 花生過敏9-13
• 1.1.1 花生過敏簡介9-10
• 1.1.2 花生過敏原及其研究進展10-11
• 1.1.3 食物過敏的防治11-13
• 1.2 益生菌13-15
• 1.2.1 益生菌簡介13
• 1.2.2 益生菌的功能13-14
• 1.2.3 益生菌對花生過敏的防治作用14-15
• 1.2.4 益生菌用作口服疫苗15
• 1.3 課題研究意義和內容15-17
• 1.3.1 本課題研究意義15-16
• 1.3.2 主要研究內容16-17
• 第二章 Lactobacillus casei Zhang 對花生過敏的影響17-29
• 2.1 實驗材料17-19
• 2.1.1 菌株17
• 2.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件17
• 2.1.3 實驗動物17
• 2.1.4 主要試劑及試劑盒17-18
• 2.1.5 主要儀器與設備18
• 2.1.6 溶液的配制18-19
• 2.2 實驗方法19-22
• 2.2.1 花生粗蛋白（CPE）的提取19
• 2.2.2 CPE 的 SDS-PAGE 電泳分析及蛋白濃度測定19
• 2.2.3 菌株的培養(yǎng)19-20
• 2.2.4 動物實驗20
• 2.2.5 花生過敏反應各項指標的檢測20-22
• 2.2.6 數(shù)據(jù)處理22
• 2.3 結果與討論22-28
• 2.3.1 花生粗蛋白的蛋白濃度及組分22
• 2.3.2 花生過敏癥狀的評分22-23
• 2.3.3 L. casei Zhang 對小鼠血清總 IgE 抗體的影響23-24
• 2.3.4 小鼠血清中特異性抗體的檢測24-25
• 2.3.5 小鼠血清中 MCP-1 含量和糞便中組胺含量的檢測25-26
• 2.3.6 L. casei Zhang 對小鼠糞便中總 IgA 抗體的影響26-27
• 2.3.7 體外細胞因子的檢測27-28
• 2.4 本章小結28-29
• 第三章 Ara h 2.02 在大腸桿菌中的表達、純化及多克隆抗體的制備29-41
• 3.1 實驗材料29-31
• 3.1.1 菌株與質粒29
• 3.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件29
• 3.1.3 工具酶與試劑29-30
• 3.1.4 主要儀器與設備30
• 3.1.5 溶液的配制30
• 3.1.6 PCR 引物30-31
• 3.2 實驗方法31-34
• 3.2.1 Ara h 2.02 蛋白的信號肽預測31
• 3.2.2 Ara h 2.02 基因的密碼子優(yōu)化與合成31
• 3.2.3 大腸桿菌表達載體 pET-nh2 的構建31-33
• 3.2.4 Ara h 2.02 蛋白在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達及純化33-34
• 3.2.5 重組蛋白制備多克隆抗體34
• 3.3 結果與討論34-40
• 3.3.1 Ara h 2.02 蛋白的信號肽預測34-35
• 3.3.2 Ara h 2.02 基因的密碼子優(yōu)化35-36
• 3.3.3 大腸桿菌表達載體 pET-nh2 的構建36-38
• 3.3.4 Ara h 2.02 蛋白在大腸桿菌 BL21（DE3）中的誘導表達38-39
• 3.3.5 Ara h 2.02 蛋白的純化及多克隆抗體的效價39-40
• 3.4 本章小結40-41
• 第四章 Ara h 2.02 在乳酸乳球菌中的表達及花生過敏重組乳酸菌口服疫苗的研究41-60
• 4.1 實驗材料41-43
• 4.1.1 菌株與質粒41
• 4.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件41-42
• 4.1.3 工具酶與試劑42
• 4.1.4 實驗動物42
• 4.1.5 主要儀器與設備42
• 4.1.6 主要溶液的配制42-43
• 4.1.7 PCR 引物43
• 4.2 實驗方法43-49
• 4.2.1 低過敏原性 mAra h 2.02 基因的制備43-45
• 4.2.2 乳酸乳球菌表達載體 pNZ-nh2 及 pNZ-mh2 的構建45-46
• 4.2.3 重組蛋白在乳酸乳球菌中的誘導表達及 Western blot 檢測分析46-47
• 4.2.4 花生粗蛋白(CPE)的提取及鑒定47
• 4.2.5 灌胃用重組菌的制備47-48
• 4.2.6 動物實驗48
• 4.2.7 花生過敏反應各項指標的檢測48-49
• 4.2.8 數(shù)據(jù)處理49
• 4.3 結果與討論49-58
• 4.3.1 低過敏原性 mAra h 2.02 基因的獲得49-51
• 4.3.2 乳酸乳球菌表達載體 pNZ-nh2 及 pNZ-mh2 的構建51-52
• 4.3.3 重組菌 L. lactis NZNH 和 L. lactis NZMH 中表達蛋白的鑒定52-53
• 4.3.4 花生過敏癥狀的評分53-54
• 4.3.5 重組乳酸菌對小鼠血清總 IgE 抗體的影響54-55
• 4.3.6 小鼠血清中特異性抗體的檢測55-56
• 4.3.7 小鼠血清中 MCP-1 含量和糞便中組胺含量的檢測56-57
• 4.3.8 重組乳酸菌對小鼠糞便中總 IgA 抗體的影響57
• 4.3.9 體外細胞因子的檢測57-58
• 4.4 本章小結58-60
• 主要結論60-61
• 存在的問題與展望61-62
• 致謝62-63
• 參考文獻63-69
• 附錄69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王斌;但國蓉;袁靜;魏泓;;乳桿菌黏附抑制致病性大腸桿菌對腸上皮樣細胞侵襲的初步研究[J];解放軍醫(yī)學雜志;2006年06期

本文編號：677115