本文關(guān)鍵詞：花生過敏重組乳酸菌口服疫苗的制備及其效果的評(píng)價(jià)

  更多相關(guān)文章： 乳酸菌 花生過敏 口服疫苗 重組表達(dá)

【摘要】：花生過敏是一種常見的食物過敏，具有發(fā)病率高、臨床癥狀嚴(yán)重和危險(xiǎn)性高的特點(diǎn)，不易產(chǎn)生免疫耐受。目前避免接觸含有花生過敏原的食物是防治花生過敏的唯一途徑，因此尋求一種安全有效的預(yù)防花生過敏的方法具有重要意義。乳酸菌被公認(rèn)為是安全的食品級(jí)微生物，部分菌株防治過敏性疾病的作用已獲得了肯定，利用乳酸菌表達(dá)各種抗原以制備口服疫苗的研究日益受到人們的關(guān)注。本文以乳酸菌作為宿主菌株表達(dá)花生過敏原Ara h2.02，旨在研究探索一種安全、有效、方便的新型花生過敏口服疫苗。 本文首先通過小鼠模型，研究干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Zhang）在抗花生過敏方面的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服L. casei Zhang進(jìn)行預(yù)防或治療處理后，小鼠花生過敏癥狀顯著減輕，血清中總IgE、特異性IgE和MCP-1的水平明顯降低，糞便中組胺的含量下降，而血清特異性IgG2a和黏膜總IgA水平有所上升。體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)表明，L. casei Zhang能顯著降低Th2細(xì)胞的反應(yīng)，減少IL-4的分泌，而對(duì)IL-12以及IFN-γ的表達(dá)水平并沒有明顯的影響，但I(xiàn)FN-γ/IL-4的比例顯著增加。這些結(jié)果表明，L. casei Zhang能促使Th2優(yōu)勢(shì)反應(yīng)向Th1反應(yīng)轉(zhuǎn)變，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能，從而起到預(yù)防和治療花生過敏反應(yīng)的作用。 為了得到純化的Ara h2.02蛋白及anti-Ara h2.02多克隆抗體用于后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)，本研究構(gòu)建含有密碼子優(yōu)化的nAra h2.02基因的大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)載體pET-nh2，并轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3），以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的His-Ara h2.02蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后，目的蛋白純度為85%，將其用于免疫兔子得到效價(jià)為1:50000的多克隆抗體。 為降低天然過敏原在免疫治療中誘發(fā)過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，本文對(duì)nAra h2.02基因進(jìn)行了序列重排及定點(diǎn)突變，得到低過敏原性的mAra h2.02基因。采用L. casei Zhang作為宿主菌株構(gòu)建口服疫苗，但結(jié)果表明nAra h2.02和mAra h2.02基因在L. casei Zhang中表達(dá)不成功。而乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作為乳酸菌的模式菌，常被用作宿主菌株表達(dá)外源蛋白。因此選擇L. lactis NZ9000作為宿主菌株，重新構(gòu)建花生過敏口服疫苗。將乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ-nh2和pNZ-mh2電擊轉(zhuǎn)化L. lactis NZ9000后，成功地誘導(dǎo)表達(dá)了目標(biāo)蛋白。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)該口服疫苗，結(jié)果顯示，重組乳酸菌口服疫苗能顯著減輕小鼠花生過敏的癥狀，抑制小鼠體內(nèi)Th2型過敏反應(yīng)（總IgE、特異性IgE抗體、MCP-1、組胺以及IL-4細(xì)胞因子），，增加Th1型特異性IgG2a抗體水平，同時(shí)上調(diào)IFN-γ/IL-4的比例。這些結(jié)果表明，重組乳酸菌花生過敏口服疫苗，尤其是低過敏原性的重組菌，能抑制Th2反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)Th1反應(yīng)，從而預(yù)防花生過敏。 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種安全、有效的花生過敏口服疫苗，為花生過敏的預(yù)防提供了新的思路和方法。
【關(guān)鍵詞】：乳酸菌 花生過敏 口服疫苗 重組表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 前言9-17
• 1.1 花生過敏9-13
• 1.1.1 花生過敏簡(jiǎn)介9-10
• 1.1.2 花生過敏原及其研究進(jìn)展10-11
• 1.1.3 食物過敏的防治11-13
• 1.2 益生菌13-15
• 1.2.1 益生菌簡(jiǎn)介13
• 1.2.2 益生菌的功能13-14
• 1.2.3 益生菌對(duì)花生過敏的防治作用14-15
• 1.2.4 益生菌用作口服疫苗15
• 1.3 課題研究意義和內(nèi)容15-17
• 1.3.1 本課題研究意義15-16
• 1.3.2 主要研究?jī)?nèi)容16-17
• 第二章 Lactobacillus casei Zhang 對(duì)花生過敏的影響17-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 2.1.1 菌株17
• 2.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件17
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.1.4 主要試劑及試劑盒17-18
• 2.1.5 主要儀器與設(shè)備18
• 2.1.6 溶液的配制18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-22
• 2.2.1 花生粗蛋白（CPE）的提取19
• 2.2.2 CPE 的 SDS-PAGE 電泳分析及蛋白濃度測(cè)定19
• 2.2.3 菌株的培養(yǎng)19-20
• 2.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)20
• 2.2.5 花生過敏反應(yīng)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)20-22
• 2.2.6 數(shù)據(jù)處理22
• 2.3 結(jié)果與討論22-28
• 2.3.1 花生粗蛋白的蛋白濃度及組分22
• 2.3.2 花生過敏癥狀的評(píng)分22-23
• 2.3.3 L. casei Zhang 對(duì)小鼠血清總 IgE 抗體的影響23-24
• 2.3.4 小鼠血清中特異性抗體的檢測(cè)24-25
• 2.3.5 小鼠血清中 MCP-1 含量和糞便中組胺含量的檢測(cè)25-26
• 2.3.6 L. casei Zhang 對(duì)小鼠糞便中總 IgA 抗體的影響26-27
• 2.3.7 體外細(xì)胞因子的檢測(cè)27-28
• 2.4 本章小結(jié)28-29
• 第三章 Ara h 2.02 在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備29-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒29
• 3.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件29
• 3.1.3 工具酶與試劑29-30
• 3.1.4 主要儀器與設(shè)備30
• 3.1.5 溶液的配制30
• 3.1.6 PCR 引物30-31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3.2.1 Ara h 2.02 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)31
• 3.2.2 Ara h 2.02 基因的密碼子優(yōu)化與合成31
• 3.2.3 大腸桿菌表達(dá)載體 pET-nh2 的構(gòu)建31-33
• 3.2.4 Ara h 2.02 蛋白在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達(dá)及純化33-34
• 3.2.5 重組蛋白制備多克隆抗體34
• 3.3 結(jié)果與討論34-40
• 3.3.1 Ara h 2.02 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)34-35
• 3.3.2 Ara h 2.02 基因的密碼子優(yōu)化35-36
• 3.3.3 大腸桿菌表達(dá)載體 pET-nh2 的構(gòu)建36-38
• 3.3.4 Ara h 2.02 蛋白在大腸桿菌 BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)38-39
• 3.3.5 Ara h 2.02 蛋白的純化及多克隆抗體的效價(jià)39-40
• 3.4 本章小結(jié)40-41
• 第四章 Ara h 2.02 在乳酸乳球菌中的表達(dá)及花生過敏重組乳酸菌口服疫苗的研究41-60
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料41-43
• 4.1.1 菌株與質(zhì)粒41
• 4.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件41-42
• 4.1.3 工具酶與試劑42
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42
• 4.1.5 主要儀器與設(shè)備42
• 4.1.6 主要溶液的配制42-43
• 4.1.7 PCR 引物43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法43-49
• 4.2.1 低過敏原性 mAra h 2.02 基因的制備43-45
• 4.2.2 乳酸乳球菌表達(dá)載體 pNZ-nh2 及 pNZ-mh2 的構(gòu)建45-46
• 4.2.3 重組蛋白在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及 Western blot 檢測(cè)分析46-47
• 4.2.4 花生粗蛋白(CPE)的提取及鑒定47
• 4.2.5 灌胃用重組菌的制備47-48
• 4.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)48
• 4.2.7 花生過敏反應(yīng)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)48-49
• 4.2.8 數(shù)據(jù)處理49
• 4.3 結(jié)果與討論49-58
• 4.3.1 低過敏原性 mAra h 2.02 基因的獲得49-51
• 4.3.2 乳酸乳球菌表達(dá)載體 pNZ-nh2 及 pNZ-mh2 的構(gòu)建51-52
• 4.3.3 重組菌 L. lactis NZNH 和 L. lactis NZMH 中表達(dá)蛋白的鑒定52-53
• 4.3.4 花生過敏癥狀的評(píng)分53-54
• 4.3.5 重組乳酸菌對(duì)小鼠血清總 IgE 抗體的影響54-55
• 4.3.6 小鼠血清中特異性抗體的檢測(cè)55-56
• 4.3.7 小鼠血清中 MCP-1 含量和糞便中組胺含量的檢測(cè)56-57
• 4.3.8 重組乳酸菌對(duì)小鼠糞便中總 IgA 抗體的影響57
• 4.3.9 體外細(xì)胞因子的檢測(cè)57-58
• 4.4 本章小結(jié)58-60
• 主要結(jié)論60-61
• 存在的問題與展望61-62
• 致謝62-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 附錄69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王斌;但國(guó)蓉;袁靜;魏泓;;乳桿菌黏附抑制致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮樣細(xì)胞侵襲的初步研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2006年06期

本文編號(hào)：677115