本文關(guān)鍵詞：生長(zhǎng)因子基因在損傷兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)

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【摘要】：目的:分離、培養(yǎng)及鑒定體外兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；建立軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法并獲得足量穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞；建立體外兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷模型；通過實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，分析損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)因子表達(dá)。 方法:1.取4周齡健康新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨，以機(jī)械分離和酶階段消化分離相結(jié)合的方法獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；體外培養(yǎng)、傳代，，觀察不同培養(yǎng)階段細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)；CCK-8法測(cè)定增殖，繪制生長(zhǎng)曲線；行甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定軟骨細(xì)胞。2.軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)并劃傷，建立體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞劃傷模型。3.顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞在劃傷前后的形態(tài)變化；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)劃傷前和劃傷后1，3，7天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（insulin-like growthfactor，IGF-1）和Ⅱ型膠原（collagenⅡ）基因mRNA表達(dá)。 結(jié)果:1.兔軟骨軟骨經(jīng)兩步消化，可獲取高純度的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞活性率可達(dá)95%以上，甲苯胺藍(lán)染色及免疫熒光呈陽性結(jié)果。原代細(xì)胞和第一代細(xì)胞呈多角形，傳代4~5代后，細(xì)胞形態(tài)逐漸由多角形變?yōu)樗笮危|(zhì)分泌氨基多糖(GAGs)和膠原染色變淺。2.成功建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)劃傷模型，細(xì)胞劃傷后劃痕兩側(cè)邊緣整齊，隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，細(xì)胞伸出突起并向劃痕區(qū)延伸，劃痕區(qū)開始出現(xiàn)軟骨細(xì)胞，并相互間發(fā)生融合。3.在細(xì)胞劃傷模型中，細(xì)胞劃傷后VEGF和bFGF基因都呈明顯低水平表達(dá)。而TGF-β1、IGF-Ⅰ和Ⅱ型膠原基因卻呈現(xiàn)較高表達(dá)水平。VEGF基因在細(xì)胞損傷第3天的表達(dá)高峰后開始回落，而bFGF、TGF-β1及Ⅱ型膠原基因在損傷的第1天表達(dá)明顯降低（P0.05），隨后呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。IGF-Ⅰ基因在損傷初期表達(dá)變化平穩(wěn)，在損傷第3天后出現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)(P0.05)。 結(jié)論:成功建立了簡(jiǎn)單宜行的軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法，通過傳代獲取大量實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，但僅限于五代以內(nèi)適用于組織工程研究之用；成功在體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并建立劃傷模型；在損傷模型中bFGF、TGF-β1、VEGF、IGF-Ⅰ和Ⅱ型膠原基因表達(dá)水平存在差異性，這為選擇合適的基因治療軟骨損傷提供重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：軟骨細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 劃傷模型 生長(zhǎng)因子 實(shí)時(shí)PCR
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-22
• 實(shí)驗(yàn)材料11-14
• 實(shí)驗(yàn)方法14-22
• 結(jié)果22-35
• 討論35-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 致謝45-46
• 附錄46-58
• 附錄A 中英文對(duì)照46-47
• 附錄B 主要試劑配制方法47-49
• 附錄C 個(gè)人簡(jiǎn)歷49-50
• 附錄D 綜述50-58
• 參考文獻(xiàn)55-58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 孫壯;褚立希;;關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)及其在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J];上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2008年04期

2 王傳家,李宇,紀(jì)影暢,李國(guó)強(qiáng),許紅權(quán);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β_1對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成糖胺多糖的作用[J];汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年03期

3 劉凌;張洪濤;王現(xiàn)彬;朱光明;楊惠林;;腺病毒介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因?qū)ν密浌羌?xì)胞的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2008年50期

4 宋衛(wèi)東,劉尚禮,李衛(wèi)平,沈慧勇,黃東生,黃建榮;人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)法的改良及其特有表型的檢測(cè)[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2003年02期

5 沈是銘,毛賓堯;關(guān)節(jié)軟骨的自分泌調(diào)節(jié)[J];中國(guó)矯形外科雜志;2000年02期

6 師忠芳;韓明;徐立新;董麗萍;袁芳;;體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷模型[J];中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐;2007年12期

本文編號(hào)：656587