本文關(guān)鍵詞：隱孢子蟲CypA蛋白對單核巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞的免疫調(diào)控作用研究

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【摘要】：研究目的： 隱孢子蟲親環(huán)素（Cyclophilin，CypA）是否為分泌性蛋白，對免疫細(xì)胞具有功能調(diào)控作用尚不清楚，研究隱孢子蟲CypA對巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控作用，篩選對巨噬細(xì)胞具有調(diào)控作用的CypA來源的多肽，并揭示其調(diào)控作用的信號(hào)通路機(jī)制。基于隱孢子蟲感染人體后的第一道防線是固有免疫，巨噬細(xì)胞是固有免疫中的重要細(xì)胞，研究隱孢子蟲分泌的CypA對巨噬細(xì)胞的功能的影響對于理解隱孢子蟲的免疫逃逸和機(jī)會(huì)致病性具有一定意義。 研究方法： 1、隱孢子蟲CypA蛋白為分泌性蛋白的確定 利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pGEX-4T-1-CypA全長及pGEX-4T-1-CypA-30質(zhì)粒中的目的基因片段CypA全長及CypA-30，設(shè)計(jì)真核表達(dá)載體pcDNA3.1+的相關(guān)引物，PCR擴(kuò)增CypA全長及CypA-30基因片段，亞克隆CypA-pcDNA3.1~+全長、CypA-30-pcDNA3.1~+及pcDNA3.1~+真核表達(dá)質(zhì)粒。通過雙酶切跑DNA電泳及測序鑒定為正確的重組載體后，將上述三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，菌落PCR以大量擴(kuò)增目的基因，再通過質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，將上述三種正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，收集上清及細(xì)胞，Westernblot檢測CypA的分泌情況。 2、隱孢子蟲CypA蛋白和其來源多肽對THP-1細(xì)胞功能的調(diào)控 將上述真核重組CypA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入THP-1細(xì)胞，cck-8檢測CypA對THP-1細(xì)胞增殖的影響。根據(jù)生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)并合成CypA來源的α、β、γ三段多肽，應(yīng)用不同濃度組的多肽刺激THP-1細(xì)胞，篩選出對THP-1細(xì)胞具有調(diào)控作用的多肽濃度；應(yīng)用該濃度多肽作用THP-1細(xì)胞，cck-8檢測細(xì)胞增殖作用；流式細(xì)胞儀檢測其對THP-1細(xì)胞周期及凋亡的影響；ELISA法測定THP-1細(xì)胞中IL-8及TNF-α細(xì)胞因子的分泌情況；Westernblot檢測CypA來源多肽對THP-1細(xì)胞信號(hào)通道的影響。 研究結(jié)果： 1、隱孢子蟲CypA蛋白為分泌性蛋白的實(shí)驗(yàn)證實(shí) 成功擴(kuò)增CypA全長及CypA-30基因片段，雙酶切及跑DNA電泳鑒定為正確的重組質(zhì)粒，測序結(jié)果也證實(shí)是正確的重組質(zhì)粒。CypA-pcDNA3.1~+全長、CypA-30-pcDNA3.1~+及pcDNA3.1~+轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞后，收集細(xì)胞上清及細(xì)胞，通過Westernblot發(fā)現(xiàn)CypA-pcDNA3.1~+全長組上清及細(xì)胞中都能檢測到CypA蛋白；CypA-30-pcDNA3.1~+組細(xì)胞中能檢測到CypA蛋白，而上清中沒有；pcDNA3.1~+組上清及細(xì)胞中都沒有CypA蛋白，說明CypA是分泌性蛋白。 2、CypA來源多肽的合成及其對THP-1細(xì)胞功能的調(diào)控及細(xì)胞信號(hào)通道的影響 上述三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入THP-1細(xì)胞，cck-8檢測CypA對THP-1細(xì)胞增殖沒有促進(jìn)作用。應(yīng)用CypA來源的不同濃度組的α、β、γ三段多肽刺激THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)β多肽對THP-1細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用；流式細(xì)胞儀檢測β多肽對THP-1細(xì)胞周期及凋亡的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Westernblot檢測CypA來源β多肽對THP-1細(xì)胞ERK1/2及JNK表達(dá)與磷酸化產(chǎn)生影響；ELISA法測定THP-1細(xì)胞中IL-8及TNF細(xì)胞因子的分泌在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異。 結(jié)論： 成功構(gòu)建CypA-pcDNA3.1~+全長、CypA-30-pcDNA3.1~+重組質(zhì)粒，確定了CypA是一個(gè)分泌性蛋白，為我們研究CypA對細(xì)胞功能的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。CypA來源的β多肽對THP-1細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，并且對THP-1細(xì)胞ERK1/2及JNK表達(dá)與磷酸化產(chǎn)生影響，，很有可能CypA來源的β多肽是通過ERK1/2及/或JNK細(xì)胞信號(hào)通道來調(diào)控THP-1細(xì)胞的增殖作用。
【關(guān)鍵詞】：隱孢子蟲 CypA β多肽 THP-1細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R382.3
【目錄】：

• 中文摘要3-7
• Abstract7-12
• 前言12-17
• 1.1 CypA與寄生蟲13
• 1.2 CypA參與炎癥反應(yīng)13-14
• 1.3 CypA與腫瘤的發(fā)生14-15
• 1.4 CypA與艾滋病的關(guān)系15-16
• 1.5 CypA與THP-1細(xì)胞16
• 1.6 研究目的、內(nèi)容與意義16-17
• 2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線17-19
• 2.1 第一部分技術(shù)路線17-18
• 2.2 第二部分技術(shù)路線18-19
• 3 材料和方法19-35
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑19-20
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備20-22
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 3.4 實(shí)驗(yàn)步驟24-35
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-49
• 5 討論49-54
• 6 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-66
• 附錄一 中英文縮略詞表66-68
• 附錄二 在校期間論文發(fā)表的情況68-69
• 附錄三 本研究基金資助69-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號(hào)：641788