本文關(guān)鍵詞：篩選與CVB3 VP3蛋白相互作用的人細(xì)胞蛋白

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【摘要】：目的： 從人心臟cDNA文庫中篩選出與CVB3VP3蛋白相互作用的人細(xì)胞蛋白。 方法： 1.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出VP3基因，將其插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7中構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3； 2.采用乙酸鋰法將pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)化至酵母菌AH109中，通過表型鑒定、PCR法驗(yàn)證質(zhì)粒pGBKT7-VP3是否轉(zhuǎn)化至酵母菌中； 3.利用Western blot檢測酵母菌AH109[pGBKT7-VP3]中VP3蛋白的表達(dá)； 4.利用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基以及酶底物X-α-Gal的變化情況檢測VP3基因?qū)?bào)告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的轉(zhuǎn)錄自激活作用； 5.經(jīng)小規(guī)模配合試驗(yàn)檢測VP3蛋白對酵母菌配合功能的影響； 6.利用大規(guī)模酵母配合實(shí)驗(yàn)篩選人心臟cDNA文庫； 7.經(jīng)陽性克隆的表型確定、PCR擴(kuò)增cDNA插入片段和Alu I酶切等試驗(yàn)將陽性克隆歸類，并進(jìn)行測序和同源性比對分析； 8.采用α-半乳糖苷酶定量分析VP3蛋白與各陽性蛋白之間相互作用的強(qiáng)弱； 9.利用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基以及酶底物X-α-Gal的變化情況檢測陽性文庫質(zhì)粒pGADT7-ADx對報(bào)告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的轉(zhuǎn)錄自激活作用； 10.利用回返配合試驗(yàn)對篩出的各陽性蛋白與VP3蛋白的相互作用再次進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1.雙酶切及序列分析提示VP3基因已成功插入pGBKT7載體的多克隆位點(diǎn)，并且閱讀框與病毒VP3基因一致； 2.表型鑒定和PCR法驗(yàn)證pGBKT7-VP3質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中； 3. Western blot證實(shí)酵母菌AH109[pGBKT7-VP3]能表達(dá)VP3蛋白； 4.營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal變化情況顯示VP3蛋白對報(bào)告基因無轉(zhuǎn)錄自激活作用； 5.小規(guī)模配合試驗(yàn)表明VP3蛋白在AH109的表達(dá)基本不影響酵母菌正常的配合功能。 6.以CVB3VP3為誘餌蛋白，從人心臟cDNA文庫中篩選到50個陽性候選克隆； 7.經(jīng)陽性候選克隆的初步分析將陽性克隆歸為10類，，并經(jīng)測序和同源性比對，最后共獲得10種不同類別的陽性蛋白：線粒體乙醛脫氫酶2（ALDH2）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間室蛋白1（ERGIC1）、真核翻譯起始因子4A2（EIF4A2）、肌鈣蛋白I3型（TNNI3）、平滑肌蛋白3（LMOD3）、羥酰輔酶A脫氫酶三官能蛋白轉(zhuǎn)錄變體3（HADHB）、門冬酰胺酶同系物（ASPG）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、肌肉型肌酸激酶（CKM）、骨骼肌α1肌動蛋白(ACTA1)。 8. α-半乳糖苷酶定量試驗(yàn)進(jìn)一步證明了篩選出的10種陽性蛋白與VP3蛋白均有較強(qiáng)的相互作用； 9.篩選出的10種陽性蛋白對報(bào)告基因無轉(zhuǎn)錄自激活作用； 10.回返配合試驗(yàn)再次驗(yàn)證10種陽性蛋白與VP3蛋白存在相互作用。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGBKT7-VP3； 2. CVB3VP3蛋白是一個適合用于酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌蛋白； 3.以CVB3VP3為誘餌蛋白，應(yīng)用大規(guī)模酵母配合實(shí)驗(yàn)，從人心臟cDNA文庫中獲得10種與VP3蛋白發(fā)生相互作用的人細(xì)胞蛋白：ALDH2、ERGIC1、EIF4A2、TNNI3、 GAPDH、LMOD3、HADHB、ASPG、CKM、ACTA1；
【關(guān)鍵詞】：柯薩奇病毒 VP3 質(zhì)粒構(gòu)建 酵母雙雜交系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-12
• 第1章 引言12-17
• 1.1 柯薩奇病毒 B 組 3型（Coxsackievirus group B type 3,CVB3）12-14
• 1.2 VP3 蛋白14
• 1.3 酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system,YTS)14-16
• 1.4 本論文研究基礎(chǔ)和研究意義16-17
• 第2章 材料與方法17-41
• 2.1 材料17-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-41
• 2.2.1 pGBKT7-VP3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建（如圖 2.1）25-31
• 2.2.2 pGBKT7-VP3 重組質(zhì)粒在酵母菌 AH109 中的表達(dá)31-33
• 2.2.3 檢測 DNA-BD-c-Myc-VP3 融合蛋白對報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄自激活33-34
• 2.2.4 檢測 DNA-BD-c-Myc-VP3 融合蛋白對酵母菌配合的影響34
• 2.2.5 大規(guī)模酵母配合實(shí)驗(yàn)34-36
• 2.2.6 陽性候選克隆的初步分析36-38
• 2.2.7 α-半乳糖苷酶定量分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)弱38-40
• 2.2.8 檢測篩選出的 10種陽性蛋白對報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄自激活作用40
• 2.2.9 回返配合實(shí)驗(yàn)40-41
• 第3章 結(jié)果41-53
• 3.1 VP3 基因的擴(kuò)增41
• 3.2 重組質(zhì)粒 pGBKT7-VP3 的酶切分析41-42
• 3.3 重組質(zhì)粒 pGBKT7-VP3 的基因測序42
• 3.4 AH109 菌株的表型驗(yàn)證42
• 3.5 陽性酵母菌 AH109[pGBKT7-VP3]的表型驗(yàn)證42-43
• 3.6 陽性酵母菌 AH109[pGBKT7-VP3]中 VP3 基因的驗(yàn)證43
• 3.7 VP3 融合蛋白表達(dá)的檢測43-44
• 3.8 檢測 VP3 融合蛋白對報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄自激活作用44-45
• 3.9 DNA-BD-c-Myc-VP3 蛋白對酵母配合功能影響的檢測45
• 3.10 人心臟 cDNA 文庫滴定45
• 3.11 陽性候選克隆酶切歸類45-46
• 3.12 DNA序列測定和同源性分析46-48
• 3.13 VP3 蛋白與 10種陽性蛋白相互作用強(qiáng)弱的分析48-50
• 3.14 篩選出的 10種陽性蛋白對報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄自激活作用50-52
• 3.15 VP3 蛋白與 10種陽性蛋白相互作用的進(jìn)一步驗(yàn)證52-53
• 第4章 討論53-60
• 4.1 質(zhì)粒構(gòu)建載體的選擇53-54
• 4.2 VP3 蛋白作為誘餌蛋白的可行性54
• 4.3 研究與 VP3 蛋白相互作用蛋白的方法選擇54-55
• 4.4 與 VP3相互作用的 10 種人細(xì)胞蛋白55-60
• 4.4.1 TNNI355-56
• 4.4.2 ALDH256-57
• 4.4.3 ERGIC157
• 4.4.4 CKM57-58
• 4.4.5 EIF4A258
• 4.4.6 ACTA158
• 4.4.7 LMOD358-59
• 4.4.8 HADHB59
• 4.4.9 GAPDH59
• 4.4.10 ASPG59-60
• 第5章 結(jié)論與展望60-61
• 5.1 結(jié)論60
• 5.2 展望60-61
• 致謝61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 附圖69-70
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果70-71
• 綜述71-78
• 參考文獻(xiàn)76-78

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 劉發(fā)娣;余克花;羅達(dá)亞;徐秋芳;莫冰;羅軍;劉晶星;黃孝天;;酵母雙雜交技術(shù)篩選與CVB3 VP1直接作用的細(xì)胞蛋白[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2009年10期

2 陳婉南;劉玲玲;吳云麗;焦伯延;林萬松;林旭;;酵母雙雜交篩選與乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝細(xì)胞蛋白[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2010年10期

3 張國壽;羅順峰;吳燕斌;池閩輝;劉景豐;;酵母雙雜交法篩選與受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白相互作用的蛋白[J];腫瘤;2011年09期

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本文編號：630063