本文關鍵詞：病原微生物的基于熔解曲線的最小化多位點序列分型

  更多相關文章： 基于熔解曲線的最小化多位點序列分型 單核苷酸多態(tài)性 沙門氏菌 金黃色葡萄球菌 D值

【摘要】：病原微生物引起的傳染性疾病是全球公共衛(wèi)生領域面臨的嚴峻課題。通過病原微生物分型,可實現(xiàn)對病原微生物的流行病學調(diào)查、跟蹤和阻斷傳播途徑以遏制其暴發(fā)流行。理想的病原微生物分子分型技術,應具有分型能力強、操作簡便、重復性好、準確快速、高通量自動化、成本低廉的特點。本論文以沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為模型,建立了一種新型的數(shù)字化病原微生物分子分型技術-基于熔解曲線的最小化多位點序列分型(minim McMLST)。 第一章,闡述了病原微生物分型的意義。探討了目前病原微生物分型技術的研究現(xiàn)狀,重點介紹和比較了各種核酸指紋分型技術的優(yōu)缺點,總結(jié)了一個理想分型技術應具備的特點。最后,在多位點序列分型技術(MLST)和多色熔解曲線分析(MMCA)的基礎上,提出了minim McMLST方法,本方法可利用MLST序列型(STs)中最少的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點達到病原微生物分型的目的。 第二章,首先詳細的闡述了minim McMLST方法的分型原理。然后以沙門氏菌為模型,對minim McMLST技術的可行性進行了初步的研究,建立了雙反應三重熒光PCR的沙門氏菌分型體系。利用Minimum SNPs軟件對1560個STs進行分析,共篩選出6個具有顯著分型能力的SNPs位點,另外,人工添加了1個SNP位點,用于區(qū)分中國最流行的兩種STs。理論上,這7個位點可將1560個STs分成了59種熔解類型(MTs)。本體系的特異性高,重復性好,檢測下限可達到5copies/反應。對167份標本進行檢測,共發(fā)現(xiàn)17種MTs。測序驗證了52份代表菌株,分析顯示,探針覆蓋區(qū)與測序結(jié)果完全一致。利用PHYLIP軟件的非加權組平均法(UPGMA)對52份標本構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,直觀顯示出,本方法獲得了17種MTs,而MLST方法獲得了23種STs。相對于MLST方法,計算出本方法的Simpson's index of diversity (D)等于0.9818。 第三章,在上述基礎上通過進一步增加SNPs位點的選擇,探討提高minim McMLST分辨率的途徑。我們以金黃色葡萄球菌為模型,建立了三管三重的金黃色葡萄球菌分型體系。該體系所檢測的SNPs位點增至15個,理論上可將2151個序列型分成288種MTs。實驗檢測了376份標本,獲得29種MTs。測序驗證的70份代表菌株顯示,探針覆蓋區(qū)與測序結(jié)果完全一致。利用PHYLIP的UPGMA算法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,本方法獲得了24種MTs,而MLST方法獲得了29種STs。相對于MLST方法,計算出D值為0.9884。進一步利用goeBURST-1.2.1對70份菌株進行了克隆譜系分析,我們的方法未區(qū)分的菌株在MLST中均被劃分到了相同的克隆群中,其溯源分析能力與MLST開始趨于一致。標本的分型正確率為97.19%。最后,通過對376標本的耐藥狀態(tài)檢測,我們觀察到熔解類型與菌株的甲氧西林耐藥性表現(xiàn)出明顯的相關性,因此,基因分型對臨床用藥具有潛在的指導價值。
【關鍵詞】：基于熔解曲線的最小化多位點序列分型 單核苷酸多態(tài)性 沙門氏菌 金黃色葡萄球菌 D值
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R372
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 緒論14-24
• 第一節(jié) 病原微生物的分型現(xiàn)狀15-18
• 1.1 表型分型技術介紹15
• 1.2 核酸指紋分型技術介紹15-18
• 第二節(jié) 論文研究的目的、內(nèi)容及意義18-20
• 參考文獻20-24
• 第二章 沙門氏菌的基于熔解曲線的最小化多位點序列分型24-58
• 第一節(jié) 基于熔解曲線的最小化多位點序列分型24-27
• 1.1 minim McMLST技術的原理和流程24-26
• 1.2 minim McMLST設計原則26-27
• 1.3 Simpson's index of diversity27
• 第二節(jié) 沙門氏菌的簡介27-29
• 第三節(jié) 材料和方法29-37
• 3.1 實驗菌株29
• 3.2 菌株培養(yǎng)和基因組DNA的提取29
• 3.3 SNPs位點的篩選29-30
• 3.4 探針和引物的設計30-34
• 3.5 兩管三重分型體系的建立34
• 3.6 體系靈敏度34
• 3.7 標本檢測34
• 3.8 標本測序驗證34-35
• 3.9 統(tǒng)計學分析35-37
• 第四節(jié) 結(jié)果與分析37-51
• 4.1 探針與靶序列的預雜交實驗37
• 4.2 兩管三重分型體系的建立和優(yōu)化37-43
• 4.3 等位基因圖譜43-44
• 4.4 體系靈敏度44-45
• 4.5 標本檢測45-47
• 4.6 標本測序驗證47-49
• 4.7 minim McMLST與MLST分型結(jié)果的比較49-51
• 第五節(jié) 討論51-54
• 參考文獻54-58
• 第三章 金黃色葡萄球菌的基于熔解曲線的最小化多位點序列分型58-98
• 第一節(jié) 金黃色葡萄球菌的簡介58-60
• 第二節(jié) 材料和方法60-68
• 2.1 實驗菌株60
• 2.2 菌株培養(yǎng)和基因組DNA的提取60-61
• 2.3 SNPs位點的篩選61
• 2.4 探針和引物的設計61-65
• 2.5 三管三重分型體系的建立65
• 2.6 體系靈敏度65
• 2.7 標本檢測65
• 2.8 標本測序驗證65-66
• 2.9 統(tǒng)計學分析66-68
• 第三節(jié) 結(jié)果與分析68-91
• 3.1 探針與靶序列的預雜交實驗68-69
• 3.2 三管三重分型體系的建立和優(yōu)化69-70
• 3.3 體系靈敏度70-83
• 3.4 等位基因圖譜83-84
• 3.5 標本檢測84-85
• 3.6 標本測序驗證85-88
• 3.7 minim McMLST與MLST分型結(jié)果的比較88-91
• 第四節(jié) 討論91-93
• 參考文獻93-98
• 英文縮寫索引98-99
• 致謝99-100

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張少敏;徐建國;;多位點序列分型及其應用[J];疾病監(jiān)測;2008年10期

2 Simon Shane;志強;;美國蛋品工業(yè)與沙門氏菌雞蛋召回事件[J];中國牧業(yè)通訊;2011年07期

3 楊建秀;食品安全與食源性疾病[J];熱帶醫(yī)學雜志;2004年02期

4 謝學勤;高建華;楊曉英;李洪權;張永強;劉澤軍;;當前新發(fā)傳染病的流行特點及防控建議[J];首都公共衛(wèi)生;2007年05期

5 張志偉;陳大鵬;張曹進;許廣平;張志勇;;半滑舌鰨基因組的提取及ISSR反應體系的建立[J];生物技術;2006年06期

6 李維彬;郭辰虹;王玉炯;;病原微生物快速檢測方法及研究進展[J];生物技術通報;2006年02期

7 劉金華;賀丹;楊艷秋;張波;王麗;;多位點測序分型技術在病原微生物分型鑒定中的應用[J];微生物學通報;2007年06期

8 李雪;金莉莉;王秋雨;;病原微生物分子分型技術研究進展[J];中國公共衛(wèi)生;2007年03期

9 馬俊英;劉健華;陳杖榴;曾振靈;;細菌分型的分子生物學技術研究進展[J];中國獸醫(yī)科學;2007年10期

10 烏正賚,曾光;病原微生物的耐藥性問題[J];中華流行病學雜志;1997年02期

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本文編號：629915