本文關(guān)鍵詞：過表達人LDH-C的CHO細胞株構(gòu)建及其對乳酸代謝和細胞凋亡影響的研究

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【摘要】：重組蛋白藥物因為其具有高活性、特異性強、低毒性、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用的特點，已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于治療各種疾病包括自身免疫性疾病、腫瘤等。但是生產(chǎn)能力不足已經(jīng)成為重組藥物發(fā)展的瓶頸，為滿足不斷擴大的市場需要，重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的增加不僅僅通過擴大反應(yīng)器的體積來實現(xiàn)，更重要的是通過細胞工程技術(shù)改造獲得一個細胞生長周期長，產(chǎn)量高，代謝廢物少、抗凋亡的細胞株。 在CHO細胞生長過程中，特別是在分批培養(yǎng)過程的后期，乳酸積累是限制細胞密度的重要原因之一，，乳酸還會導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降，而在生物反應(yīng)器中為調(diào)整pH值添加堿性物質(zhì)還會導(dǎo)致滲透壓升高，進而對細胞的生長產(chǎn)生不利的影響，最終導(dǎo)致細胞活率以及蛋白產(chǎn)量的降低。 LDH-C基因存在于精子細胞、睪丸細胞和某些腫瘤中，作為乳酸脫氫酶（LDH）的一個亞型，同乳酸脫氫酶A和B相比，LDH-C更偏向于利用乳酸作為底物，催化乳酸向丙酮酸方向發(fā)生反應(yīng)。LDH-C有助于精子在高乳酸的環(huán)境中生存，同時它允許乳酸作為細胞能量的來源。雖然LDH-C在CHO細胞中的作用目前還不清楚，但是LDH-C可以作為細胞工程上的一個有趣的靶點，它可能會使CHO細胞代謝向有氧乳酸代謝方向轉(zhuǎn)變，改善細胞生長的高乳酸環(huán)境。因此我們猜想在CHO細胞中過表達LDH-C基因可能會對改善細胞培養(yǎng)的高乳酸環(huán)境從而抑制細胞凋亡。 本課題研究旨在通過在CHO細胞中過表達人LDH-C基因，改善細胞培養(yǎng)后期的高乳酸環(huán)境，從而減少高乳酸引起的細胞凋亡。本研究的意義在于為減少代謝副產(chǎn)物乳酸提供新的途徑，為提高抗體或重組蛋白類藥物的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。 【目的】在工程細胞CHO中過表達乳酸脫氫酶（LDH-C）基因，旨在利用基因工程手段構(gòu)建出培養(yǎng)時間長、代謝副產(chǎn)物少、抗凋亡的細胞株，為抗體產(chǎn)量的增加奠定基礎(chǔ)。 【方法】運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）從人SKBR-3細胞中擴增出LDH-C基因，經(jīng)雙酶切（XhoⅠ和Hind Ⅲ）后與真核表達載體pcDNA3.0相連接，利用Lipo2000轉(zhuǎn)染至CHO細胞，經(jīng)G418加壓篩選獲得穩(wěn)定表達LDH-C的單克隆細胞株。經(jīng)Real-time PCR檢測LDH-C基因在mRNA水平的表達量，挑選出三株表達量比較高的細胞株進行補料分批培養(yǎng)，通過對比實驗組細胞CHO/LDH-C和對照組細胞CHO/pcDNA3.0的生長曲線、細胞活率以及IVCC曲線等參數(shù)，獲得一株IVCC值最高的細胞。 在三種不同的分批補料培養(yǎng)條件下，觀察LDH-C對細胞生長的影響，每天記錄細胞生長的密度，并用臺盼藍拒染法計算細胞的活率，同時每天檢測細胞培養(yǎng)上清中代謝產(chǎn)物乳酸的含量，以研究LDH-C對CHO代謝的影響。 對CHO/LDH-C進行細胞周期檢測、Annexin V與PI雙染檢測細胞凋亡率、JC-1染色檢測兩組細胞的線粒體膜電位以及western-blot檢測細胞凋亡通路中的相關(guān)蛋白表達，以研究LDH-C對凋亡的影響。 【結(jié)果】（1）成功克隆人LDH-C基因，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.0/LDH-C，并成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO/LDH-C細胞株。通過Real-timePCR鑒定、流加培養(yǎng)生長曲線以及酶活鑒定等實驗獲得一株LDH-C表達量較高，生長密度較高的6號克隆CHO/LDH-C#6作為后續(xù)實驗的研究對象。同時，選取CHO/pcDNA3.0#4作為實驗的對照組。 （2）在初始培養(yǎng)條件下，兩組細胞的生長無明顯差別，但是在第三天分別加入40mM丙酮酸鈉或者40mM乳酸鈉后，對照組細胞的生長受到了抑制，而轉(zhuǎn)染了LDH-C的實驗組細胞生長密度顯著高于對照組細胞，并且在這兩種培養(yǎng)條件下實驗組細胞的乳酸濃度明顯低于對照組，特別是在流加培養(yǎng)的后期，LDH-C的作用更加顯著，可以顯著性降低乳酸濃度。 （3）利用流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的CHO/LDH-C細胞S期增加，說明處于DNA復(fù)制期的細胞增多，增殖活性增加。流式檢測細胞凋亡、western-blot以及線粒體膜電位檢測均顯示CHO/LDH-C細胞細胞凋亡降低，說明過表達LDH-C通過可以抑制CHO細胞的凋亡。 【全文結(jié)論】本課題成功構(gòu)建穩(wěn)定表達人LDH-C基因的CHO/LDH-C細胞，并在補料分批培養(yǎng)中通過添加乳酸及丙酮酸鈉模擬高乳酸環(huán)境，研究了此基因過表達對CHO細胞在高乳酸環(huán)境下存活的影響，并對高乳酸引起的凋亡進行了研究。研究表明，在未添加乳酸或丙酮酸鈉的低乳酸環(huán)境下，LDH-C過表達未改善細胞生長及活率。而在乳酸及丙酮酸鈉添加條件下，LDH-C過表達的CHO細胞具有更高的細胞密度和細胞活率，而且其乳酸濃度與對照組相比顯著降低。此外，LDH-C過表達的細胞具有更快的增殖以及更強的抗凋亡能力。
【關(guān)鍵詞】：中華倉鼠卵巢細胞 補料分批培養(yǎng) LDH-C 乳酸 抗凋亡
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-18
• 第一部分 穩(wěn)定表達人 LDH-C 基因的 CHO 細胞株構(gòu)建18-33
• 第二部分 LDH-C 基因?qū)?CHO 細胞生長以及乳酸代謝影響的研究33-41
• 第三部分 LDH-C 基因?qū)?CHO 細胞抗凋亡能力影響的研究41-52
• 結(jié)論與展望52-53
• 參考文獻53-56
• 綜述56-73
• 參考文獻67-73
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表及待發(fā)表的論文73-74
• 本課題的受資助情況74-75
• 縮寫詞表75-76
• 致謝76-78

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 靖鈺;過表達人LDH-C的CHO細胞株構(gòu)建及其對乳酸代謝和細胞凋亡影響的研究[D];蘇州大學(xué);2014年

本文編號：615725