本文關(guān)鍵詞：P選擇素、P選擇素糖蛋白配體-1在大鼠深靜脈血栓模型中的表達(dá)變化初步研究

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【摘要】：[目的] 1.建立大鼠深靜脈血栓模型,并觀察不同時(shí)間段下血栓形成的狀態(tài)。 2.檢測大鼠DVT模型血液、下腔靜脈壁組織中P-selectin、PSGL-1的mRNA、蛋白表達(dá),初步探討P-selectin、PSGL-1表達(dá)變化與DVT形成過程的相關(guān)性。 3.采用生物信息學(xué)P-selectin、SGL-1與調(diào)控白細(xì)胞黏附并促進(jìn)血栓形成間的聯(lián)系,使進(jìn)一步更有針對(duì)性的研究白細(xì)胞粘附的分子機(jī)制在血栓形成中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [材料與方法] 1.將88只SD大鼠參照隨機(jī)分組原則分為對(duì)照組(n=8)、假手術(shù)組(n=40)和實(shí)驗(yàn)組(n=40),其中對(duì)照組不進(jìn)行任何處理；實(shí)驗(yàn)組采用下腔靜脈部分瘀滯法(狹窄法)制備深靜脈血栓模型；假手術(shù)組在分離下腔靜脈后,用結(jié)扎線將靜脈勒緊后立刻放開。分別于造模后6h、24h、48h、72h及7d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn),在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各將8只造模后的大鼠過量麻醉后(腎靜脈以上)行下腔靜脈采血,將獲得的大鼠抗凝全血一部分保存于RNALock血液RNA穩(wěn)定劑內(nèi),用PCR法檢測TF、PSGL-1及P-selectin的基因表達(dá)；另一部分抗凝全血離心后分離出血漿置于-80℃,用ELISA法檢測PSGL-1及P-selectin在血液中的表達(dá)；同時(shí)留取距結(jié)扎線1.0cm的下腔靜脈及其內(nèi)容物并分成兩份,一份置于4%多聚甲醛中送組織病理檢測,另一部分將靜脈壁分離出來后立刻置于液氮罐中用于Western-Blot檢測。 2.肉眼大致觀察血栓狀態(tài),判斷標(biāo)準(zhǔn)：開腹后見造模段下腔靜脈顏色、腫脹程度、局部組織反應(yīng)程度、血管腔內(nèi)是否有可見的凝塊狀物質(zhì)。 3、對(duì)大鼠的靜脈組織行組織病理切片后HE染色,觀察不同時(shí)間點(diǎn)靜脈內(nèi)血栓形成情況。 4.用Kit法提取血液總RNA, RT-PCR將各組大鼠血液RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物,以GAPDH為內(nèi)參照,用Real-time PCR法檢測PSGL-1及P-selectin基因的表達(dá)定量。 5.ELISA法分別檢測血液內(nèi)PSGL-1及P-selectin的表達(dá)量；Western-Blot法檢測靜脈壁組織內(nèi)PSGL-1的表達(dá)變化。 6.分析探討血栓形成過程中PSGL-1及P-selectin的表達(dá)與白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞粘附,促進(jìn)血栓形成間的作用關(guān)系。 [結(jié)果] 1.實(shí)驗(yàn)組大鼠DVT模型建立后6h、24h、48h、72h及7d較對(duì)照組觀察,均可見明顯肉眼血栓形成,靜脈壁管壁內(nèi)可見血栓組織形成；HE組織染色顯示在造模后6h起,大鼠下腔靜脈中均有大部分的血栓形成,24h時(shí)間點(diǎn)可見完全性血栓形成,部分與血管壁粘連；血栓內(nèi)主要為血小板梁、纖維素和紅細(xì)胞,并可見不同程度的炎細(xì)胞侵潤；72h至7d時(shí)間點(diǎn)除上述病理表現(xiàn)外,同時(shí)可見明顯血管壁內(nèi)的炎細(xì)胞明顯侵潤；對(duì)照組及假手術(shù)組組織切片未見異常。 2.實(shí)驗(yàn)組大鼠PSGL-1及P-selectin mRNA在血液白細(xì)胞中的表達(dá)呈增高總趨勢,其中6h、24h均呈升高的趨勢(P0.05),72h及7d與對(duì)照組比較無明顯變化(P0.05),48h組其表達(dá)量與6h、24h組比較雖呈下降趨勢但無明顯變化(P0.05)但較對(duì)照組表達(dá)仍呈升高趨勢；72h、7d組較48h組雖有下降趨勢,但與較對(duì)照組比較無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。所有對(duì)照組與假手術(shù)組比較表達(dá)無明顯差異(P0.05)。 3.實(shí)驗(yàn)組PSGL-1及P-selectin蛋白在血液內(nèi)的表達(dá)呈先升高后逐漸下降趨勢,于造模后6h開始升高趨勢(P0.05),24h達(dá)到高峰,7d時(shí)呈下降減弱趨勢(P0.05)；大鼠靜脈壁組織Western-Blot檢測PSGL-1結(jié)果顯示DVT模型6h、24h組大鼠較對(duì)照組表達(dá)呈升高趨勢(P0.05),至48h仍有升高趨勢且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h和7d雖有升高趨勢但與對(duì)照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；所有對(duì)照組與假手術(shù)組比較表達(dá)無明顯差異(P0.05)。 4.生物信息學(xué)分析表明：白細(xì)胞膜表面表達(dá)的PSGL-1(配體)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上表達(dá)的P-selectin(受體)相互間發(fā)生結(jié)合,使內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞發(fā)生粘附,從而激活了活內(nèi)皮細(xì)胞中的ERK通路及胞核內(nèi)NF-kB信號(hào)通路,MCP-1、TF等分泌增加,進(jìn)而促進(jìn)血栓形成。 [結(jié)論] 1.大鼠下腔靜脈部分瘀滯法(狹窄法)建立大鼠DVT模型6h可形成完全血栓。 2.大鼠DVT模型血液中P-selectin、PSGL-1的mRNA.蛋白表達(dá)變化與血栓形成進(jìn)程相關(guān)。 3. PSGL-1、P-selectin的相互作用可調(diào)控單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的起始粘附過程,并能激活ERK及NF--kB信號(hào)通路使TF表達(dá)升高,從而加速血栓的形成。
【關(guān)鍵詞】：組織因子 P選擇素糖蛋白配體1 P選擇素 深靜脈血栓
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R543.6;R-332
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 中英文縮略詞表11-12
• 前言12-17
• P-selectin、PSGL-1在大鼠深靜脈血栓模型中的表達(dá)變化17-38
• 一、DVT大鼠模型建立及取材17-20
• 二. 大鼠下腔靜脈組織的組織切片及HE染色20-22
• 三. Real-time PCR檢測DVT大鼠血液中P-selectin、PSGL-1的表達(dá)22-32
• 四. ELISA檢測P-selectin、PSGL-1在血液中的表達(dá)變化32-34
• 五. Western-blot檢測PSGL-1在靜脈壁中的表達(dá)變化34-37
• 六. 生物信息學(xué)技術(shù)分析P-selectin、PSGL-1與血栓形成間的關(guān)系37
• 七.統(tǒng)計(jì)分析37-38
• 結(jié)果38-48
• 1. 動(dòng)物建模結(jié)果38-40
• 2、Real-time PCR檢測大鼠DVT模型時(shí)P-selectin、PSGL-1在血液白細(xì)胞中的表達(dá)40-43
• 3、TF、P-selectin、PSGL-1 ELISA檢測結(jié)果43-45
• 4、Western-blot檢測下腔靜脈壁組織PSGL-1的表達(dá)45-46
• 5. Pathway分析結(jié)果46-48
• 討論48-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 綜述62-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 在讀期間基本情況70-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：615649