發(fā)布時間：2017-08-03 14:11

  本文關(guān)鍵詞：TLRs介導(dǎo)的GLUTs和MCTs表達(dá)變化對神經(jīng)元存活的影響及其機制

  更多相關(guān)文章： 神經(jīng)元 葡萄糖轉(zhuǎn)運體 單羧酸轉(zhuǎn)運體 Toll樣受體

【摘要】：葡萄糖是神經(jīng)元活動的主要燃料，神經(jīng)活動引起能量需求增加主要通過葡萄糖的氧化代謝來滿足。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運是通過其細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運體（glucose transporters，GLUTs）家族實現(xiàn)的。在哺乳動物大腦利用葡萄糖的過程中，主要是GLUT1和GLUT3在發(fā)揮作用。大腦神經(jīng)元主要表達(dá)GLUT3、GLUT6和GLUT8。胰島素、神經(jīng)生長因子或H2O2等可以通過PI3K-AKT、MAPKs、cAMP或NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)GLUT3的表達(dá)和葡萄糖的攝取。近年來的研究表明，神經(jīng)活動期間神經(jīng)元能夠攝取膠質(zhì)細(xì)胞釋放的乳酸作為其主要能量代謝底物。糖酵解產(chǎn)生的乳酸通過細(xì)胞膜上的單羧酸轉(zhuǎn)運體（monocarboxylate transporters，MCTs）轉(zhuǎn)運出膠質(zhì)細(xì)胞，使神經(jīng)元很容易通過自身膜上的MCTs將乳酸攝入，以滿足神經(jīng)元活動期間增加的能量需求。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）表達(dá)MCT1、MCT2和MCT4，其中MCT2主要表達(dá)于神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，去甲腎上腺素可通過PI3K-Akt和mTOR/S6K途徑增加MCT2的表達(dá)。曾有實驗報道，當(dāng)神經(jīng)元處于富含葡萄糖和乳酸的環(huán)境中時，會優(yōu)先使用乳酸作為主要的氧化底物。該結(jié)果表明即使是在血糖正常的情況下乳酸也可優(yōu)先于葡萄糖作為腦代謝的燃料。 Toll樣受體（Toll-like receptors, TLR）是一種重要的模式識別受體（patternrecognition receptor, PRRs），能夠識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen associatedmolecular pattern, PAMPs)，構(gòu)成機體抵御病原體入侵的第一道防線。現(xiàn)有的文獻表明，人和小鼠的CNS也表達(dá)TLRs，它們在一系列CNS感染和非感染疾病中起著十分重要的作用。最近幾年越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)TLR家族的多個成員，TLR3和TLR8首先分別被發(fā)現(xiàn)在人神經(jīng)元細(xì)胞系和小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中表達(dá)，正常小鼠神經(jīng)元表達(dá)TLR1-8和TLR10-13的mRNA和TLR2、TLR6的蛋白；病毒感染后神經(jīng)元細(xì)胞的TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，表明TLRs在神經(jīng)元病毒感染中起著十分重要的作用。有報道表明激活TLR9能夠使神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的能量底物減少并使AMP/ATP比值增加，進而激活A(yù)MP激活的蛋白激酶（AMPK），從而使神經(jīng)元的缺氧性應(yīng)激耐受力增加，并且沒有典型的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生；在骨髓來源的脂肪細(xì)胞中，激活TLR3或TLR4能夠?qū)е翯LUT4表達(dá)下降并降低胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取和增加脂肪分解。另有報道表明，神經(jīng)元能量缺失后能夠?qū)е缕銽LR2和TLR4的表達(dá)上調(diào)，進而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，這些結(jié)果表明TLRs在參與細(xì)胞的能量代謝方面起著十分重要的作用。病毒感染神經(jīng)元后，在其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中就合成了dsRNA和ssRNA，這些dsRNA和ssRNA能夠作為病原相關(guān)分子模式而被神經(jīng)元的TLR3、TLR7和TLR8等識別，從而啟動免疫應(yīng)答。本課題中我們用ply(I:C)（一種合成的dsRNA，模擬病毒dsRNA）和R848（一種合成的化合物，TLR7和TLR8的特異性配體）分別模擬dsRNA和ssRNA刺激體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞，初步研究了dsRNA與TLR3相互作用或ssRNA與TLR7/8相互作用是否會影響神經(jīng)元GLUTs和MCTs的表達(dá)，從而影響神經(jīng)元對葡萄糖和乳酸的利用，并且是否因此影響神經(jīng)元的存活及其相關(guān)機制，以期探討病毒感染神經(jīng)元過程中其dsRNA和ssRNA通過TLRs介導(dǎo)造成的神經(jīng)病理損傷機制，為神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染性疾病的防治研究提供新的理論依據(jù)。 第一部分TLRs激活對體外胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存活的影響 目的：建立胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系，用poly(I:C)或R848處理胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，觀察TLR3或TLR7/8激活是否會影響胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的存活。 方法：選取孕16-18d的C57BL/6野生型孕鼠和TLR3-/-型孕鼠，脫頸處死后取出胎鼠大腦皮質(zhì)部分，剪碎、消化、吹打后制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板上，用Neurobasal培養(yǎng)基（含2%B27、1%胎牛血清和1%谷氨酰胺）體外培養(yǎng)8d成為成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，以MAP2作為神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物，以DAPI標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核，熒光顯微鏡下計數(shù)所有表達(dá)MAP2的細(xì)胞個數(shù)和所有細(xì)胞核的個數(shù)，計算出神經(jīng)元細(xì)胞所占比率，具體計算公式為MAP2標(biāo)記細(xì)胞個數(shù)/DAPI染色的細(xì)胞個數(shù)，以此檢測體外培養(yǎng)的神經(jīng)元純度；用poly(I:C)刺激培養(yǎng)8天后的神經(jīng)元，按照對照組、不同濃度poly(I:C)刺激分組，在作用不同時間后，通過MTT法檢測野生型和TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞活性；通過流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測野生型和TLR3-/-型神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。用R848刺激野生型神經(jīng)元，用MTT法檢測其細(xì)胞活性，與對照組即僅DMSO處理組進行比較。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞純度達(dá)到90%以上，可以用于后續(xù)實驗。poly(I:C)和R848分別刺激神經(jīng)元后，都能夠?qū)е乱吧吞ナ笃べ|(zhì)神經(jīng)元活性顯著降低，，而poly(I:C)不能使TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的活性顯著降低。FCM結(jié)果也表明，poly(I:C)刺激神經(jīng)元24h后，野生型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的早期凋亡和晚期凋亡比對照組增多，而TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的刺激組和對照組無明顯差異。 結(jié)論：poly(I:C)能夠通過激活TLR3影響神經(jīng)元細(xì)胞的存活，并且導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，而R848也能通過激活TLR7/8導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。 第二部分TLRs介導(dǎo)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GLUTs和MCTs表達(dá)變化 目的：研究poly(I:C)激活TLR3和R848激活TLR7/8是否會影響胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞GLUTs和MCTs mRNA和蛋白的表達(dá)。 方法：以體外培養(yǎng)8d、純度達(dá)到90%以上的神經(jīng)元細(xì)胞作為研究對象，實驗分為：對照組、20μg/ml終濃度的poly(I:C)處理不同時間（1h、4h、10h、15h）組、不同濃度的poly(I:C)（10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）刺激相同時間（10h）組、30μg/ml終濃度的R848處理不同時間（1h、4h、12h、15h）組、不同濃度的R848（5μg/ml、30μg/ml、60μg/ml）刺激相同時間（12h）組等，然后抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過Real-timePCR法檢測GLUTs和MCTs的mRNA表達(dá)變化；再按照對照組、20μg/ml終濃度的poly(I:C)處理不同時間（12h、24h、36h）組、不同濃度的poly(I:C)（10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）刺激相同時間（24h）組、30μg/ml終濃度的R848處理不同時間（12h、24h、36h）組、不同濃度的R848（5μg/ml、30μg/ml、60μg/ml）刺激相同時間（24h）組，收集細(xì)胞抽提蛋白質(zhì)，通過Western blotting檢測GLUTs和MCTs蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，poly(I:C)刺激神經(jīng)元細(xì)胞不同時間，TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GLUTs和MCTs的mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化；野生型胎鼠神經(jīng)元細(xì)胞的GLUT3、GLUT8和MCT2的mRNA在刺激10h后表達(dá)下降，20μg/ml poly(I:C)刺激神經(jīng)元24h后GLUT3、GLUT8和MCT2的蛋白表達(dá)水平明顯下降，且隨著刺激時間的延長，GLUT3、GLUT8和MCT2的蛋白表達(dá)水平下降更為明顯；而用R848刺激野生型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞后能夠?qū)е翯LUT3和MCT2mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，并且隨著刺激濃度的增加而增加。 結(jié)論：poly(I:C)刺激神經(jīng)元細(xì)胞后能夠?qū)е翯LUT3、GLUT8和MCT2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下降，而R848刺激神經(jīng)元細(xì)胞后能夠上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、MCT2的mRNA和蛋白表達(dá)。 第三部分TLRs介導(dǎo)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GLUTs和MCTs表達(dá)變化的相關(guān)分子機制初探 目的：探討poly（I:C）激活TLR3和R848激活TLR7/8影響神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUT3、GLUT8和MCT2的相關(guān)機制。 方法：體外培養(yǎng)8d純度達(dá)到90%以上的神經(jīng)元細(xì)胞作為研究對象，按照對照組、20μg/ml終濃度poly（I:C）刺激組、30μg/ml終濃度R848刺激組、20μg/ml終濃度poly（I:C）+PDTC/bx-795（或PDTC/bx-795）刺激組分組，Real-time PCR檢測poly(I:C)或R848刺激后神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IFN-β、TNF-α、IL-6mRNA的變化；ELISA檢測IFN-β、TNF-α、IL-6蛋白水平；Western Blot檢測TLR3信號通路相關(guān)分子TBK1、IRF3、IRF7、NF-κB、p38、ERK、JNK等的磷酸化水平。Real-time PCR和Western Blot方法檢測分別加入兩種信號通路抑制劑預(yù)處理再用poly(I:C)刺激后，神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、GLUT8和MCT2的mRNA和蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果：poly(I:C)刺激胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元10h后，細(xì)胞的IFN-β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)上調(diào)， IL-6和IFN-β蛋白表達(dá)增加，R848刺激胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元12h后，細(xì)胞的IFN-β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)上調(diào)，但是只有IFN-β蛋白表達(dá)增加。Western Blot結(jié)果顯示，經(jīng)poly（I:C)刺激后，神經(jīng)元細(xì)胞TBK1、IRF3、IRF7、p65的磷酸化水平上調(diào)，然而p38、ERK和JNK的磷酸化水平未發(fā)生變化。分別用NF-κB的抑制劑PDTC和TBK1的抑制劑bx-795處理細(xì)胞，然后用poly(I:C)刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用PDTC預(yù)處理后能夠部分抑制poly(I:C)下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、GLUT8和MCT2表達(dá)的作用，而用bx-795預(yù)處理對poly(I:C)下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、GLUT8和MCT2表達(dá)的作用沒有影響。 結(jié)論：TLR3可能通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUT3、GLUT8和MCT2，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙，從而影響神經(jīng)元細(xì)胞的存活，并且可能與激活TLR3或TLR7/8誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)元 葡萄糖轉(zhuǎn)運體 單羧酸轉(zhuǎn)運體 Toll樣受體
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 縮略詞14-15
• 前言15-18
• 第一部分：TLRs 激活對體外胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活的影響18-28
• 材料和方法18-21
• 結(jié)果21-25
• 討論25-28
• 第二部分：TLRs 介導(dǎo)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元 GLUTs 和 MCTs 表達(dá)變化28-43
• 材料和方法28-33
• 結(jié)果33-41
• 討論41-43
• 第三部分：TLRs 介導(dǎo)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元 GLUTs 和 MCTs 表達(dá)下調(diào)的相關(guān)分子機制初探43-56
• 材料和方法43-49
• 結(jié)果49-54
• 討論54-56
• 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻57-62
• 文獻綜述62-70
• 參考文獻67-70
• 致謝70

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4 王彬;李霞;張s

本文編號：614740