發(fā)布時間：2017-08-03 14:21

  本文關(guān)鍵詞：利用TALEN技術(shù)高效敲除金黃地鼠Rag1基因及金黃地鼠γ-干擾素單克隆抗體的初步制備

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【摘要】：金黃地鼠(Golden hamster; Mesocricetus auratus)又稱敘利亞地鼠。金黃地鼠已經(jīng)作為感染和疾病模型用于許多研究,它經(jīng)常被用于模擬人疾病在自然條件下的發(fā)生過程。金黃地鼠相對于其他嚙齒類動物相比自然狀態(tài)下腫瘤發(fā)病比率相對較低,有研究稱只有0.5%-17%,因此說金黃地鼠是一個很好的腫瘤模型。重要的是金黃地鼠已經(jīng)被公認為是一個寶貴的模式動物用于研究由病毒引起的人類疾病。例如布亞病毒(bunyaviruses),沙粒病毒(arenaviruses),蟲媒病毒(flaviviruses),漢尼拔病毒(henipaviruses)和SARS冠狀病毒。用金黃地鼠作為一個評價溶腫瘤腺病毒的療效和毒性的腫瘤動物模型具有小鼠和大鼠無法比擬的先天優(yōu)勢。由于小鼠正常組織不支持人腺病毒復(fù)制,因此,小鼠模型無法很好的評價溶腫瘤腺病毒。而金黃地鼠被美國FDA認為是評價溶腫瘤腺病毒標準的動物模型,金黃地鼠正常組織如肺、肝臟都能支持腺病毒的復(fù)制。 金黃地鼠是近幾年才被大家廣泛接受的一種模式動物,基于金黃地鼠的轉(zhuǎn)基因動物和抗體還十分的稀少。無法對利用金黃地鼠為動物模型的實驗進行深入的探討,限制了金黃地鼠的應(yīng)用。因此我們圍繞金黃地鼠動物模型的兩個方面設(shè)計了實驗。第一,利用新型基因修飾技術(shù)類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子敲除金黃地鼠Ragl基因制備免疫缺陷的轉(zhuǎn)基因金黃地鼠。第二,運用傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)制備金黃地鼠γ-干擾素的單克隆抗體,用于轉(zhuǎn)基因金黃地鼠的相關(guān)實驗檢測。 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子(transcription activator-like effectors, TALE)是一種最早在植物病原黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)的,可以識別特異DNA序列的,天然的DNA結(jié)合蛋白。利用其這種特性,通過和相關(guān)功能性蛋白Fokl的融合表達,可以實現(xiàn)在體內(nèi)和體外特異的結(jié)合和修飾基因組DNA的目的。Fok1是一個非特異的核酸內(nèi)切酶,但是只有當它形成二聚體時才能行使內(nèi)切酶的功能。最近幾年,TALEN廣泛應(yīng)用于基因的敲入和敲除,轉(zhuǎn)基因動物模型建立,基因治療等方面。 經(jīng)過實驗,我們通過顯微注射把TALEN轉(zhuǎn)錄的mRNA打進斑馬魚和大鼠的受精卵中,并對結(jié)果進行測序,在斑馬魚和大鼠體內(nèi)驗證了所設(shè)計的TALEN的敲除效率,得到了一對高效TALEN,通過將此TALEN轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)顯微注射進斑馬魚和大鼠受精卵后,在斑馬魚中驗證其效率為17.9%。于此同時我們通過原核表達金黃地鼠Y-干擾素蛋白并用此蛋白免疫小鼠,經(jīng)過細胞融合和克隆篩選,也已經(jīng)成功得到5株抗金黃地鼠γ-干擾素的單克隆抗體,并用ELISA和Western Blot的方法進行了初步驗證。該研究為拓展使用金黃地鼠模型用于醫(yī)學科學研究提供了有力的工具。
【關(guān)鍵詞】：金黃地鼠 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子TALEN γ-干擾素 單克隆抗體
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：Q78;R392;R-332
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 第一部分：利用TALEN技術(shù)高效的敲除金黃地鼠Rag1基因9-20
• 1 引言9-11
• 2 實驗所需主要儀器及公司11
• 3 實驗所需試劑及配制11-13
• 4 實驗材料和方法13-16
• 5 實驗結(jié)果16-18
• 6 討論18-20
• 第二部分：金黃地鼠γ-干擾素的單克隆抗體的制備20-44
• 1 引言20-22
• 2 實驗所需主要儀器及公司22-23
• 3 試劑23-27
• 4 實驗方法27-36
• 5 實驗結(jié)果36-42
• 6 討論42-44
• 參考文獻44-46
• 綜述 新型基因修飾技術(shù)ZFN和TALEN的應(yīng)用46-60
• 參考文獻56-60
• 致謝60

【共引文獻】

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本文編號：614802