本文關(guān)鍵詞：篩選攜帶ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒載體

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【摘要】：目的：篩選能夠顯著抑制自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2（Rho-associatedcoiled-coil containing protein kinase2，ROCK2）基因表達(dá)的攜帶siRNA的慢病毒載體。方法：1.采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞。2.靶向大鼠ROCK2基因設(shè)計(jì)具有基因特異性的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，，構(gòu)建其短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)重組慢病毒表達(dá)載體。①設(shè)計(jì)RNAi靶點(diǎn)序列并合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Hpa I、XhoI進(jìn)行酶切后的GP-Supersilencing Vector載體連接產(chǎn)生shRNA慢病毒載體。②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性菌落、擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。③GP-Supersilencing Vector與三種混合包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生shRNA重組慢病毒。3.隨機(jī)將5只SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞分為6組（每組n=5），每組每個(gè)樣本3×104個(gè)細(xì)胞，分別為：A組（未轉(zhuǎn)染對(duì)照組）、B組（攜帶慢病毒轉(zhuǎn)染組）、C～F組（分別攜帶靶向ROCK2基因的siRNA1～4號(hào)靶點(diǎn)的慢病毒轉(zhuǎn)染組），以MOI=80轉(zhuǎn)染SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP表達(dá)情況，并用RT-PCR檢測(cè)各組被轉(zhuǎn)染細(xì)胞ROCK2基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果：1.經(jīng)酶切及基因測(cè)序鑒定證實(shí)重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞感染效率均大于50%。3.RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組ROCK2mRNA的表達(dá)：與A組相比，B組ROCK2基因mRNA的表達(dá)無(wú)明顯改變（P㧐0.05）；C組、D組、F組SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞ROCK2基因mRNA的表達(dá)較A組極顯著下降（P0.01），抑制效率分別達(dá)到43.91±8.19!、47.15±6.64!、25.7±6.03!；E組SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞ROCK2基因mRNA的表達(dá)較A組顯著下降（P0.05），抑制效率為16.81±5.94!。結(jié)論：1.本研究成功構(gòu)建了大鼠ROCK2基因RNAi慢病毒載體，為后續(xù)的改善SHR勃起功能的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。2.構(gòu)建的4種攜帶ROCK2基因的siRNA慢病毒載體均能夠顯著抑制SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROCK2基因的表達(dá)，其中有3種慢病毒載體抑制作用較強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：SHR大鼠 ROCK2 RNA干擾 靶點(diǎn)篩選
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-31
• 結(jié)果31-39
• 討論39-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 英漢縮略詞對(duì)照表45-46
• 致謝46-47
• 綜述47-60
• 參考文獻(xiàn)56-60

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：600435