本文關(guān)鍵詞：雙功能酶SpoT調(diào)控幽門螺桿菌適應(yīng)克拉霉素壓力機(jī)制研究

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【摘要】：目的 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是一種具有極生鞭毛的革蘭氏陰性菌,生存于人類胃黏膜表面,人類大多數(shù)在兒童早期即感染Hp,且終生攜帶。研究表明,Hp感染是胃炎胃潰瘍發(fā)生發(fā)展的重要誘因,同時(shí)也是引起胃癌及胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤的關(guān)鍵危險(xiǎn)因子。因此,1994年,Hp被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ級致癌原,因而Hp感染的治療和根除成為亟需解決的科學(xué)問題。 Hp是否完全清除與根治,直接影響上述疾病的轉(zhuǎn)歸,目前臨床上治療多采用在膠體鉍劑或質(zhì)子泵抑制劑的基礎(chǔ)上加兩種抗生素的三聯(lián)療法,克拉霉素(Clarithromycin,CLR)是新一代的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,因其易吸收,對胃酸穩(wěn)定,因此是治療幽門螺桿菌三聯(lián)療法常用的抗生素之一。最新的馬特里共識已經(jīng)將以CLR為首的三聯(lián)療法列為根除幽門螺桿菌的首選療法。但是近年來由于CLR的過量和反復(fù)使用,Hp對CLR的耐藥率國內(nèi)外均呈上升趨勢。目前對CLR耐藥機(jī)制的研究主要集中在對Hp23s rRNA基因點(diǎn)突變的分析上。但近幾年的研究發(fā)現(xiàn),許多Hp耐藥菌株的23s rRNA的基因并未發(fā)生突變,暗示23s rRNA突變并不是產(chǎn)生CLR耐藥的唯一因素,耐藥機(jī)制有待于進(jìn)一步研究,以達(dá)到對CLR的合理使用。 SpoT,最早發(fā)現(xiàn)其功能為調(diào)控大腸桿菌的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答。細(xì)菌在各種不利環(huán)境下發(fā)生的基因表達(dá)模式的改變統(tǒng)稱為嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答。調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答的是一個(gè)小的信號分子,稱作四磷酸鳥苷((p)ppGpp)。在不利環(huán)境下,大量積累的(p)ppGpp可以與RNA聚合酶結(jié)合從而改變啟動子的特嚩性和轉(zhuǎn)錄效率進(jìn)而影響參與細(xì)菌生存力及抗壓相關(guān)基因的表達(dá)變化。在大腸桿菌中,(p)ppGpp是由RelA和SpoT兩種酶調(diào)節(jié)產(chǎn)生的,而在幽門螺桿菌中僅含有SpoT,且為雙功能酶,同時(shí)具有合成和水解(p)ppGpp的活性。有研究表明,(p)ppGpp參與糞腸球菌(Enterococcus faecalis)對萬古霉素的耐受調(diào)控過程,但(p)ppGpp是否參與Hp對CLR等抗生素的耐藥調(diào)控尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。 研究表明,在革蘭氏陰性菌中,外膜通透性的降低及主動外排泵的活化是膜蛋白參與耐藥的主要貢獻(xiàn)。我們通過基因芯片預(yù)測發(fā)現(xiàn)多種膜蛋白在CLR刺激下mRNA的表達(dá)水平有明顯的變化,暗示膜蛋白在幽門螺桿菌抗CLR耐藥過程中可能發(fā)揮著重要作用,但具體機(jī)制尚未有人研究。 本研究主要探討Hp雙功能酶SpoT及其產(chǎn)物(p)ppGpp在CLR壓力環(huán)境下是否有調(diào)控作用；探索受SpoT調(diào)控的下游基因,為CLR耐受提供新的機(jī)制,為尋找新的藥物靶點(diǎn)和CLR在臨床的合理使用提供指導(dǎo)。 方法 1.同源重組法在Hp26695菌株中構(gòu)建spoT缺失突變株("縮poT), kefB缺失突變株("縦efB)及spoT回復(fù)株(spoT*)。 2.瓊脂稀釋法判定CLR的最小抑菌濃度(MIC)。用含不同遞減濃度CLR的平板接種受試菌,孵育后觀察細(xì)菌生長情況,以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。 3.檢測雙功能酶SpoT及其產(chǎn)物(p)ppGpp在CLR存在的壓力環(huán)境下的表達(dá)變化。 (1)用最小抑菌濃度(MIC)的CLR刺激野生株Hp26695,對照組為同樣培養(yǎng)的野生株Hp26695(不加CLR刺激),1h后,分別提取兩組菌的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA, Real-time PCR檢測spoT的表達(dá)。 (2)將Hp26695,"縮poT及spoT*用32p標(biāo)記一代后,用MIC的CLR分別處理野生株Hp26695,"縮poT及spoT*,對照組為同樣培養(yǎng)的野生株Hp26695,"縮poT及spoT*(不加CLR處理),1h后,分別提取六組菌的核苷酸,薄層層析法檢測(p)ppGpp合成量的變化。 4.平板菌落計(jì)數(shù)法、MIC測定以及熒光染色法比較Hp26695,"縮poT及spoT*經(jīng)CLR處理后其生存率以及MIC的變化。 5.基因芯片比較Hp26695與"縮poT在CLR最小抑菌濃度下基因表達(dá)差異。將未經(jīng)CLR刺激的野生株及"縮poT株以及經(jīng)過CLR刺激1h后的野生株和"縮poT株分別做基因芯片檢測,通過四組數(shù)據(jù)比較找出CLR壓力下可能受SpoT調(diào)控的基因。 6Real-Time PCR法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。將Hp26695,"縮poT及spoT*分別用CLR處理,對照組為同樣培養(yǎng)的三種菌(不加CLR處理),1h后,分別提取兩組菌的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,運(yùn)用Real-time PCR檢測基因芯片篩選出的基因的表達(dá)。 7.檢測受SpoT調(diào)控的基因缺失突變后Hp耐受CLR能力的影響。通過平板菌落計(jì)數(shù)法、MIC測定以及熒光染色法比較野生株與缺失突變株經(jīng)CLR處理后生存率及MIC的變化。 結(jié)果 1.在野生株Hp26695上成功構(gòu)建出spoT缺失突變株("縮poT), kefB缺失突變株("縦efB)以及在"縮poT中構(gòu)建出spoT回復(fù)株(spoT*)。 2.CLR能夠引起Hp的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答,SpoT及其產(chǎn)物(p)ppGpp參與Hp耐受CLR的調(diào)控過程。用0.125μg/mL的CLR處理Hp266951h后,與對照組相比,在mRNA水平,處理組基因spoT的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)；用32p標(biāo)記的Hp26695株,"縮poT株及spoT*株經(jīng)0.125μg/mL的CLR處理后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Hp26695株及spoT*株的(p)ppGpp的合成量均有明顯的增高,而對于"縮poT株,處理前后未見(p)ppGpp合成。 3SpoT在耐受CLR過程中確實(shí)發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步證明SpoT參與Hp耐受CLR的調(diào)控過程,我們通過平板菌落計(jì)數(shù)法、MIC測定以及熒光染色的方法比較Hp26695,"縮poT及spoT*經(jīng)CLR處理以后其生存率以及MIC的變化發(fā)現(xiàn),用5MIC的CLR分別處理三種菌,"縮poT的生存率在處理2h時(shí)即降到1%以下,而Hp26695及spoT*在處理8h后其生存率仍在10%以上；熒光染色結(jié)果顯示,5MIC的CLR處理后,"縮poT的存活率較野生株及回復(fù)株明顯降低；同樣,通過對三種菌株的MIC檢測發(fā)現(xiàn),"縮poT的MIC較野生株及回復(fù)株降低了50%左右。 4.多種膜蛋白參與Hp適應(yīng)CLR壓力過程。將未經(jīng)CLR刺激的野生株Hp26695和"縮poT株以及經(jīng)過CLR刺激1h后的野生株不(?)"縮poT的基因芯片結(jié)果比較得出,在0.125μg/mL的CLR的刺激下,野生株Hp26695中約有221個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著的變化(Fold≥3),其中占比例最高的是膜蛋白,占24%,在膜蛋白基因中有13個(gè)基因在野生株Hp26695上有顯著變化,而在"縮poT菌株中CLR處理前后基因的表達(dá)無顯著變化。 5.受SpoT調(diào)控的質(zhì)子泵KefB參與Hp適應(yīng)CLR過程。用Real-Time PCR的方法驗(yàn)證芯片預(yù)測可能受SpoT調(diào)控的基因,發(fā)現(xiàn)只有質(zhì)子泵基因kefB在Hp26695經(jīng)CLR處理后表達(dá)量明顯上調(diào)(P＜0.05),而在將spoT敲除的菌株中,經(jīng)CLR處理前后kefB表達(dá)量無明顯變化,將spoT基因回復(fù)以后,kefB的表達(dá)量又有顯著上調(diào)(P＜0.05)。 6KefB參與Hp耐受CLR過程。為進(jìn)一步證明質(zhì)子泵KefB參與Hp適應(yīng)CLR過程,我們構(gòu)建了kefB缺失突變株并通過平板菌落計(jì)數(shù)法、MIC測定以及熒光染色法比較Hp26695,"縦efB經(jīng)CLR處理后生存率以及MIC的變化。發(fā)現(xiàn),用5MIC的CLR分別處理兩種菌,"縦efB在處理4h后存活率即降到1%以下,而Hp26695與前面結(jié)果一致,處理8h后其存活率仍在10%以上；熒光染色結(jié)果顯示,5MIC的CLR處理后,"縦efB的存活率較野生株明顯降低；同樣,通過對兩種菌株的MIC檢測發(fā)現(xiàn),"縦efB的MIC較野生株下降了25%。 結(jié)論 雙功能酶SpoT及其產(chǎn)物(p)ppGpp在Hp適應(yīng)CLR過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,能夠調(diào)控下游質(zhì)子泵KefB的高表達(dá),使得細(xì)菌抵抗抗生素CLR的損害,最終使得Hp快速適應(yīng)CLR環(huán)境,為進(jìn)一步耐受應(yīng)答、耐藥株產(chǎn)生奠定了時(shí)間基礎(chǔ)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 克拉霉素 SpoT (p)ppGpp KefB
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符號說明15-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-37
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料20-26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-37
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-40
• 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 本研究未完成工作45-46
• 附圖表46-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文68-69
• 附件69

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本文編號：569442