本文關(guān)鍵詞：HBHA在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)及其抑制AECⅡ自噬作用的驗(yàn)證

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【摘要】：結(jié)核�。═uberculosis， TB）已經(jīng)成為全世界傳染病的頭號(hào)殺手。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，全球有1/3的人感染了結(jié)核病，每年新增病人約900萬(wàn)人，每年死于結(jié)核病人數(shù)達(dá)到300萬(wàn)人[1]，其中死于結(jié)核病并且艾滋病毒（HIV）陰性者就高達(dá)110萬(wàn)，而死于TB聯(lián)合HIV感染者高達(dá)35萬(wàn)[2]。更為嚴(yán)峻的是，中國(guó)每年有130萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病患者，其中，耐多藥結(jié)核菌感染者可達(dá)10萬(wàn)人[3]，是全球結(jié)核病的負(fù)擔(dān)大國(guó)。 TB的病原體是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，MTB通過空氣傳播進(jìn)入宿主的肺部，被巨噬細(xì)胞吞噬后，機(jī)體有可能依靠自身的免疫力快速消除MTB，但是如果免疫力低下就會(huì)發(fā)生活動(dòng)性肺結(jié)核，最終難以消滅[4]。MTB是否能夠成功存活于宿主細(xì)胞，取決于感染的菌量、分枝桿菌毒力以及宿主的免疫狀態(tài)。所以，通過調(diào)節(jié)和維護(hù)胞內(nèi)的信號(hào)機(jī)制以對(duì)抗MTB感染，宿主的免疫防御機(jī)制起到了十分的重要的作用[5]。 MTB的感染機(jī)制不僅僅與巨噬細(xì)胞的存在密切關(guān)系[6-9]，而且和肺泡上皮細(xì)胞存在緊密的聯(lián)系[10-14]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（Alveolar epithelial cells typeⅡ，AECⅡ）是一組具有肺泡保護(hù)活性的細(xì)胞，同時(shí)也可合成和分泌表面活性劑和細(xì)胞因子[15]，在天然免疫過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[16]。 迄今為止，發(fā)現(xiàn)的MTB的毒力因子并不多，包括有ESAT6、CFP-10、Ag85、HBHA等。其中肝素結(jié)合血凝素黏附素（Heparin-binding hemag-glutinin adhesion，HBHA）是主要的結(jié)核分枝桿菌黏附素，在細(xì)菌黏附和侵襲肺泡上皮細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要的作用。HBHA分子量為28kD，主要表達(dá)于MTB的表面，可結(jié)合肝素、硫化右旋糖苷等[17]。它有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，目前已經(jīng)明確C端結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)MTB與宿主組織的硫化糖復(fù)合物黏附[18]，還可通過補(bǔ)體C3介導(dǎo)黏附于巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，在肺外播散型結(jié)核的發(fā)生中發(fā)揮重要功能。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌HBHA蛋白具有抑制AECⅡ自噬的作用，很可能籍此幫助MTB感染AECⅡ，并發(fā)生播散。 為了進(jìn)一步證明HBHA是否通過抑制細(xì)胞自噬而輔助了細(xì)菌感染，我們以與MTB同屬的速生非致病性分枝桿菌恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS）作為載體，重組表達(dá)HBHA蛋白，驗(yàn)證了HBHA抑制自噬并促進(jìn)感染的作用。 一．重組恥垢分枝桿菌建立及驗(yàn)證 1、構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌rMS-HBHA 利用穿梭質(zhì)粒pMV261，重組表達(dá)載體pMV261-HBHA電轉(zhuǎn)化入恥垢分枝桿菌中，經(jīng)PCR鑒定正確后，命名rMS-HBHA。將rMS-HBHA通過45°C誘導(dǎo)2hrs后，超聲裂解菌體，經(jīng)SDS-PAGE電泳可見，28kD處出現(xiàn)HBHA特定蛋白條帶；Westernblot證實(shí)，目的蛋白條帶能夠結(jié)合抗HBHA多克隆抗體，證明HBHA在恥垢分枝桿菌中表達(dá)成功。 2、重組恥垢分枝桿菌rMS-HBHA生長(zhǎng)特性的觀察 用接種培養(yǎng)法將野生型MS與rMS-HBHA分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期約OD600=0.6時(shí)，調(diào)整菌量至103個(gè)/mL，培養(yǎng)4、12、24、48、72、96、120、144hrs后檢測(cè)菌OD600值，并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，與MS相比，rMS-HBHA生長(zhǎng)速率無明顯變化。 3、rMS-HBHA與A549細(xì)胞的相互作用 3.1感染A549細(xì)胞中細(xì)菌的活菌數(shù)： 分別將rMS-HBHA和MS以10:1（細(xì)菌：細(xì)胞）的MOI感染A549細(xì)胞。分別于1、10、18hrs后，加入慶大霉素100μg/ml作用1hrs來殺死細(xì)胞外殘留的活細(xì)菌，涂于7H10（OADC）固體培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)3-4d，分別計(jì)數(shù)A549細(xì)胞感染MS和rMS-HBHA后的胞內(nèi)活菌數(shù)（CFU）。結(jié)果表明， rMS-HBHA組胞內(nèi)活菌數(shù)為6.3×106，明顯高于MS組1×105，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3.2檢測(cè)rMS-HBHA和MS感染A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性： 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分為三組：實(shí)驗(yàn)組（rMS-HBHA+A549）、對(duì)照組（MS+A549）、無感染A549組，將MS和rMS-HBHA感染A549細(xì)胞，于不同的時(shí)間點(diǎn)（4、6、10、14、18hrs）收集上清培養(yǎng)液，測(cè)量OD490吸光值并繪制柱狀圖。結(jié)果表明，rMS-HBHA組細(xì)胞毒性(68%)遠(yuǎn)高于MS組(40%)，P0.05。 二、rMS-HBHA感染肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞后自噬作用的觀察 以MS和rMS-HBHA分別感染A549細(xì)胞18hrs，Western blot法鑒定A549細(xì)胞微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）的表達(dá)情況，，并檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3Ⅱ比值的變化；利用單丹磺酰尸胺（MDC）將自噬體染色后，激光共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體變化的情況。 相對(duì)野生型恥垢分枝桿菌(MS)，重組表達(dá)HBHA蛋白的恥垢分支桿菌(rMS-HBHA)可以顯著抑制A549細(xì)胞中的LC3Ⅱ和LC3Ⅱ的表達(dá)，rMS-HBHA組的LC3-Ⅱ/LC3Ⅱ比值（0.625）顯著低于MS組（2.025），表明rMS-HBHA組自噬體形成受到抑制。細(xì)胞經(jīng)MDC染色后，激光共聚焦發(fā)現(xiàn)rMS-HBHA感染的細(xì)胞自噬體成熟度顯著降低。 以上實(shí)驗(yàn)初步證明，HBHA具有增強(qiáng)MS感染與播散的作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 HBHA 恥垢分枝桿菌 自噬
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 文獻(xiàn)回顧14-19
• 實(shí)驗(yàn)一 HBHA 重組恥垢分枝桿菌的建立與鑒定19-41
• 1 材料19-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 3 結(jié)果30-39
• 4 討論39-41
• 實(shí)驗(yàn)二 HBHA 重組恥垢分枝桿菌對(duì) A549 細(xì)胞自噬的影響41-51
• 1 材料41-43
• 2 方法43-45
• 3 結(jié)果45-49
• 4 討論49-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果59-60
• 致謝60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 張海婷,曾萍,鄭家利;結(jié)核病的流行與控制對(duì)策[J];中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志;2005年S1期

2 莊玉輝,何秀云,張小剛,李國(guó)利,闕海萍,劉紹軍;結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物不同組份蛋白質(zhì)組研究[J];微生物學(xué)報(bào);2002年03期

3 王曉蕾,雷建強(qiáng),王洪海;巨噬細(xì)胞攝取結(jié)核分支桿菌相關(guān)的受體[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2003年05期

本文編號(hào)：570108