本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲差異基因的原核表達(dá)及體外抑菌活性檢測(cè)

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【摘要】：由于臨床上抗生素的廣泛不合理應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥菌株甚至是超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了人類及動(dòng)物的健康，研發(fā)出一種高效且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌制劑是目前急需解決的問題。家蠅（Musca domestica）生長環(huán)境惡劣，攜帶許多病原菌，自身卻不染病，緣于其體內(nèi)存在的抗菌活性物質(zhì)，家蠅抗菌肽就是其中之一。家蠅抗菌活性物質(zhì)作用機(jī)理獨(dú)特，且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，一定程度上可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素，已廣泛引起人們的關(guān)注。 本研究以雞源致病性大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲構(gòu)建的抑制性消減文庫（SSH）中篩選得到的差異表達(dá)基因?yàn)榛A(chǔ)，，以其cDNA為模板，利用RACE-PCR技術(shù)對(duì)家蠅溶菌酶1基因（Musca domestica lysozyme1,MdL1）及3個(gè)未知功能基因（unknown functional gene ofMusca domestica,Md-UF1, Md-UF2, Md-UF3）進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物測(cè)序及生物信息學(xué)分析。通過T-A克隆技術(shù)，將全長PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，成功構(gòu)建pMD18-T-Md-UF1、pMD18-T-Md-UF2、pMD18-T-Md-UF3、pMD18-T-MdL1克隆質(zhì)粒。將pMD18-T-Md-UF1、pMD18-T-Md-UF2、 pMD18-T-Md-UF3、 pMD18-T-MdL1基因亞克隆至pET-32a和pGEX-4T-1表達(dá)載體中，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)并用SDS-PAGE電泳分析。利用親和層析法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行體外抑菌活性分析，實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下： （1）利用RACE技術(shù)成功擴(kuò)增出Md-UF1、Md-UF2、Md-UF3及MdL1基因的全長cDNA序列，其ORF序列大小分別為840bp，990bp，297bp，432bp。 （2）核苷酸及氨基酸序列分析結(jié)果表明：Md-UF1、Md-UF2、Md-UF3基因尚未發(fā)現(xiàn)與其有同源性的基因序列；MdL1基因的mRNA全序列與GenBank登錄號(hào)為AY344589.1的同源性為96%，有5個(gè)氨基酸的差異。Md-UF1基因編碼279個(gè)氨基酸，呈親水性，不含有信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲，α-螺旋及β-折疊；Md-UF2基因編碼329個(gè)氨基酸，呈親水性，不含有信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲及β-折疊；Md-UF3基因編碼98個(gè)氨基酸，呈親水性，有信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲，α-螺旋及β-折疊；MdL1基因編碼143個(gè)氨基酸，呈親水性，有信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲，α-螺旋及β-折疊。 （3）成功構(gòu)建了pET-32a-Md-UF1、 pET-32a-Md-UF2、 pGEX-4T-1-Md-UF2、pET-32a-Md-UF3、pGEX-4T-1-Md-UF3、pET-32a-MdL1和pGEX-4T-1-MdL1重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，pGEX-4T-1-Md-UF2、pET-32a-Md-UF1、pET-32a-Md-UF3和pET-32a-MdL1成功在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物純化得到比較單一的融合蛋白，其抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Trx-6His-Md-UF1、GST-Md-UF2、Trx-6His-MdL1融合蛋白均對(duì)臨床分離的雞源大腸桿菌耐藥株具有明顯的抑制作用；Trx-6His-Md-UF1、GST-Md-UF2融合蛋白對(duì)臨床分離的雞傷寒沙門氏菌耐藥株有抑制作用；Trx-6His-Md-UF3融合蛋白對(duì)其抑制作用不明顯；四種融合蛋白均對(duì)豬源鏈球菌無抑制作用。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步研究這四種融合蛋白抗菌活性機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為臨床尋找新型抗菌藥物提供依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：家蠅抗菌肽 大腸桿菌 克隆 原核表達(dá) 抑菌活性
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R384.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一章 家蠅抗菌肽的研究進(jìn)展10-14
• 1.1 家蠅抗菌肽的分類和特征10
• 1.2 家蠅抗菌肽的作用機(jī)制10-11
• 1.3 篩選家蠅抗菌肽基因的技術(shù)11-12
• 1.4 家蠅抗菌肽基因的原核表達(dá)12-13
• 1.5 家蠅基因工程抗菌肽的生物活性13-14
• 第二章 家蠅幼蟲部分差異基因的克隆14-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 2.3 結(jié)果與分析20-26
• 2.4 討論26-27
• 2.5 小結(jié)27-28
• 第三章 家蠅全長基因的生物信息學(xué)分析28-40
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法28-29
• 3.3 結(jié)果與分析29-38
• 3.4 討論38-39
• 3.5 小結(jié)39-40
• 第四章 家蠅全長基因的原核表達(dá)、純化及體外抑菌活性檢測(cè)40-63
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-47
• 4.3 結(jié)果與分析47-60
• 4.4 討論60-62
• 4.5 小結(jié)62-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 作者簡介69-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：534165