本文關(guān)鍵詞：利用微小基因組建立評價HCV NS5B聚合酶活性的細胞系統(tǒng)

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【摘要】：丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）屬于黃病毒科（Flaviviridae），肝炎病毒屬（Hepacivirus），是引起慢性肝病的主要病原體之一。HCV感染呈全球流行狀態(tài)，是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的最主要病因，約有1.3億HCV感染者。HCV為單正鏈RNA病毒，基因組全長約為9.6kb，兩端含有5′非編碼區(qū)（5′UTR）和3′非編碼區(qū)（3′UTR），，中間為一個開放閱讀框（ORF）。開放閱讀框可編碼一個多聚蛋白前體，然后在宿主與病毒蛋白酶的共同作用下加工成為3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白分別為核心蛋白（Core）、包膜糖蛋白E1和E2，非結(jié)構(gòu)蛋白分別為p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B具有RNA依賴的RNA聚合酶（RNAdependent RNApolymerase，RdRp）活性，是HCV RNA合成和復(fù)制的關(guān)鍵酶，是抗HCV治療的關(guān)鍵靶點。隨著對病毒基因組復(fù)制機制的深入理解，利用RNA病毒的反向遺傳技術(shù)建立的微小基因組系統(tǒng)為研究HCV的復(fù)制、與宿主細胞之間的相互作用、致病機制以及抑制劑的篩選提供了新的工具，進一步為建立HCVNS5B抑制劑的高通量篩選體系提供了技術(shù)支撐。因此，本研究利用HCV NS5B的RdRp活性和反向遺傳技術(shù)，建立可評價HCV NS5B聚合酶活性的新型細胞系統(tǒng)，為HCV NS5B抑制劑的高通量篩選提供新的實驗系統(tǒng)。 基于目前國內(nèi)外學(xué)者對于HCV復(fù)制機理的最新進展，并且以本室前期的研究為基礎(chǔ)，首先分別設(shè)計并且構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP、微小基因組(-)5UIRrG(-)3U和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。然后通過將pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，檢測細胞中螢火蟲熒光素酶（FLuc）活性，對pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中NS5B活性進行了驗證。通過將pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U和pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，檢測細胞培養(yǎng)上清及細胞中的Gaussia熒光素酶（GLuc）活性，對微小基因組(-)5UIRrG(-)3U的功能進行了鑒定。主要研究結(jié)果如下： 1.成功構(gòu)建了表達HCV NS3-5B復(fù)制復(fù)合體的質(zhì)粒并鑒定了NS5B聚合酶的活性 （1）通過PCR方法擴增HCV NS3-5B全長基因片段，然后成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP。酶切鑒定以及測序比對正確后，轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，熒光成像可以觀察到綠色熒光蛋白的表達，Western Blot檢測結(jié)果顯示NS3-4A蛋白和NS5B蛋白均在細胞中得到表達。 （2）重組質(zhì)粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz（本室前期構(gòu)建）共轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，結(jié)果顯示所構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中的NS5B具有RdRp活性，并且NS3-5B復(fù)制復(fù)合體中的NS5B活性明顯高于單獨的NS5B活性。 2.成功構(gòu)建了(-)5UIRrG(-)3U微小基因組并鑒定了其功能 （1）設(shè)計了一段兩端含有HCV負鏈5′UTR和負鏈3′UTR序列，中間含有EMCVIRES-DsRed2正向序列和GLuc編碼基因的反向互補序列（rvGLuc）的微小基因組片段(-)5UIRrG(-)3U。分別設(shè)計擴增各基因片段的上下游引物，然后利用重疊延伸PCR技術(shù)將擴增出的各基因片段成功拼接。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示各基因片段大小正確。 （2）成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。酶切鑒定以及測序比對正確后，轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞后，紅色熒光蛋白得到表達，細胞內(nèi)重組質(zhì)粒中的微小基因組具有正常的功能。 3.初步建立了評價HCV NS5B聚合酶活性的細胞系統(tǒng) 在pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞中，熒光成像可以觀察到綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白同時得到表達，并且位于復(fù)制復(fù)合體中的NS5B蛋白可以使微小基因組片段進行正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，GLuc得到表達并且分泌至細胞培養(yǎng)液中，進而可以通過檢測GLuc的活性來評價NS5B聚合酶的活性。 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了HCV NS3-5B的真核表達載體和含有報告基因的微小基因組載體，將兩者組合初步建立了評價HCV NS5B聚合酶活性的細胞系統(tǒng)。此系統(tǒng)為建立NS5B抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)提供了新的途徑，并且進一步為利用該系統(tǒng)建立可用于HCV NS5B抑制劑篩選和評價的轉(zhuǎn)基因動物模型提供了實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒（HCV） NS5B 微小基因組 抑制劑篩選系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.2
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-30
• 一、HCV 的基因組與編碼蛋白的功能17-22
• 二、HCV RNA 的翻譯與復(fù)制機制22-25
• 三、HCV 微小基因組的研究25-27
• 四、NS5B 聚合酶活性評價系統(tǒng)與抑制劑的篩選27-30
• 第一部分 表達 NS3-5B 蛋白的真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及 NS5B 聚合酶活性鑒定30-46
• 1 實驗材料與儀器30-32
• 1.1 質(zhì)粒、菌株及細胞株30
• 1.2 主要試劑30-31
• 1.3 主要儀器31-32
• 2 實驗方法32-40
• 2.1 引物設(shè)計及合成32
• 2.2 重組質(zhì)粒 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 的構(gòu)建及鑒定32-36
• 2.3 細胞培養(yǎng)36
• 2.4 細胞轉(zhuǎn)染及熒光成像觀察36
• 2.5 Western Blot 檢測36-38
• 2.6 細胞轉(zhuǎn)染及螢火蟲熒光素酶（FLuc）活性檢測38-39
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析39-40
• 3 實驗結(jié)果40-43
• 3.1 重組質(zhì)粒 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 酶切鑒定及序列分析結(jié)果40
• 3.2 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 轉(zhuǎn)染細胞后熒光成像結(jié)果40-41
• 3.3 HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白 NS3-4A 和 NS5B Western Blot 檢測結(jié)果41-42
• 3.4 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 和 pCMV/5UrFI3URz 共轉(zhuǎn)染細胞后 FLuc 活性測定結(jié)果42-43
• 4 討論43-46
• 第二部分 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 重組質(zhì)粒構(gòu)建及功能鑒定46-73
• 1 實驗材料與儀器46-47
• 1.1 質(zhì)粒、菌株及細胞株46
• 1.2 主要試劑46-47
• 1.3 主要儀器47
• 2 實驗方法47-61
• 2.1 引物的設(shè)計及合成47-48
• 2.2 微小基因組片段(-)5UIRrG(-)3U 的拼接48-54
• 2.3 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 的構(gòu)建及鑒定54-57
• 2.4 細胞培養(yǎng)57
• 2.5 細胞轉(zhuǎn)染及熒光成像觀察57-59
• 2.6 細胞轉(zhuǎn)染及 Gaussia 熒光素酶（GLuc）活性檢測59-61
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析61
• 3 實驗結(jié)果61-68
• 3.1 微小基因組(-)5UIRrG(-)3U 構(gòu)建示意圖61
• 3.2 微小基因組(-)5UIRrG(-)3U 各片段 PCR 擴增結(jié)果61-63
• 3.3 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 酶切鑒定及序列分析結(jié)果63-64
• 3.4 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 轉(zhuǎn)染細胞后熒光成像結(jié)果64-65
• 3.5 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 和 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 共轉(zhuǎn)染細胞后熒光成像結(jié)果65-66
• 3.6 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 和 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 共轉(zhuǎn)染細胞后 GLuc 活性測定結(jié)果66-68
• 4 討論68-73
• 小結(jié)73-74
• 參考文獻74-85
• 個人簡歷和研究成果85-86
• 致謝86-87

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 尹偉;李成忠;;慢性丙型肝炎抗病毒治療進展[J];世界臨床藥物;2013年12期

2 韓佩君;雷迎峰;呂欣;楊敬;姚敏;喬卿華;黨品香;尹文;;丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3-5B蛋白的真核表達載體構(gòu)建及其在BHK-21細胞中的表達[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2013年36期

3 高煒;邵偉;蘇剛;李佳;謝小冬;;蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制劑高通量篩選模型的建立和應(yīng)用[J];科技導(dǎo)報;2014年Z1期

4 任華;陸威;

本文編號：531755