本文關(guān)鍵詞：C.jejuni毒力及耐藥基因的分析和糞便中的C.jejuni快速鑒定

  更多相關(guān)文章： 吉蘭—巴雷綜合征 空腸彎曲菌 毒力基因 耐藥基因 快速鑒定 PCR

【摘要】：目的:1選取空腸彎曲菌的12對(duì)毒力相關(guān)基因和8對(duì)耐藥基因?qū)?株吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)相關(guān)空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni, C.jejuni,C.J.)及NCTC11168共4種菌株進(jìn)行相關(guān)基因分析和比較，了解致C.jejuni菌株毒力基因及耐藥基因性的特征，探討C.jejuni致GBS機(jī)制。 2傳統(tǒng)的對(duì)空腸彎曲菌的分離實(shí)驗(yàn)是通過傳代進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定及生化鑒定疑似空腸彎曲菌以后再做分子方面的鑒定實(shí)驗(yàn)，至少要花費(fèi)三天的時(shí)間。常見的特異性生化實(shí)驗(yàn)馬尿酸實(shí)驗(yàn)，由于放置的時(shí)間的差異會(huì)出現(xiàn)假陰性，降低分離率。而分離方法，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)員挑取可疑單菌落，經(jīng)過純種傳代后，一些毒力及耐藥性可能因?yàn)檫@種非自然的傳代而喪失，影響我們對(duì)其分子方面的研究。本次實(shí)驗(yàn)旨在模擬從糞便中直接檢測(cè)出空腸彎曲菌的過程，找出特異性及靈敏度高的檢測(cè)方法，通過PCR對(duì)空腸彎曲菌進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的鑒定。 方法:1選取空腸彎曲菌的12對(duì)毒力相關(guān)基因包括：黏附相關(guān)基因codF和racR，鞭毛蛋白基因flaA，毒素調(diào)節(jié)基因cdtA、cdtB、cdtC、wlaN和virB11質(zhì)�；�，熱休克蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因dnaJ，ceuE，CiaB和pldA基因，8對(duì)耐藥相關(guān)基因包括對(duì)環(huán)丙沙星耐藥gyrA，parC基因，對(duì)四環(huán)素耐藥基因tet(o)，對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類耐藥基因mutation，CJ1/DP1，CJ18/CJ19和CJ20/SJ21，對(duì)妥布霉素-慶大霉素耐藥基因int1。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）對(duì)菌株的毒力及耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過擴(kuò)增出來的條帶確定空腸彎曲菌的毒力及耐藥基因的差別。 2利用平板傳代法對(duì)NC11168菌株傳代至P2代，經(jīng)過生化及分子鑒定；隨機(jī)收集病區(qū)中沒有腹瀉及吉蘭巴雷綜合征的患者的新鮮糞便16份，分別置于布氏肉湯中；將肉湯中的糞便振蕩分散后，利用濾膜過濾和PBS離心處理；在濾液中加入調(diào)整濁度后的NC11168菌液，根據(jù)添加菌液濃度的不同進(jìn)行分組，實(shí)驗(yàn)組分五組，分別為10~3個(gè)/ml組，10~4個(gè)/ml組，10~5個(gè)/ml組，10~6個(gè)/ml組及對(duì)照組；利用多重PCR及普通PCR對(duì)糞便進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果:1毒力基因flaA, cadF, racR, pldA和cdtB在四種菌株中均可被檢測(cè)到，cdtA和dnaJ在lulei，lichang，NCTC11168三種菌株中可被檢測(cè)到。 virB11在四種菌株中都沒有被檢測(cè)到，CiaB和cdtC僅在lulei中存在， wlaN基因在lulei, lichang和qiaoyuntao三種菌株中均存在， ceuE在lulei，，qiaoyuntao和NCTC11168中可檢測(cè)到。耐藥相關(guān)基因中對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類耐藥基因CJ1/DP1，在檢測(cè)的四株空腸彎曲菌中都被檢測(cè)到，CJ18/CJ19lichang,lulei和NCTC11168中檢測(cè)到，CJ20/CJ21于qiaoyuntao,NCTC11168和lulei中檢測(cè)到，mutation中沒有檢測(cè)到。環(huán)丙沙星耐藥基因gyrA和parC在檢測(cè)的四株空腸彎曲菌中都被檢測(cè)到。四環(huán)素耐藥質(zhì)�；騮et(o)，只在lichang中檢測(cè)到。對(duì)妥布霉素-慶大霉素耐藥基因int1，在qiaoyuntao株中被檢測(cè)到。 2多重PCR的結(jié)果，在五個(gè)分組中，實(shí)驗(yàn)組2中的標(biāo)號(hào)為6和8的樣本中擴(kuò)增出一條16S的基因片段，實(shí)驗(yàn)組3中編號(hào)為9的樣本擴(kuò)增出一條hipo基因片段，實(shí)驗(yàn)組4中編號(hào)為14的樣本擴(kuò)增出兩個(gè)條帶即16S，hipo的基因片段。利用16S為擴(kuò)增的目的基因的普通PCR的結(jié)果，在五個(gè)分組中，實(shí)驗(yàn)組1中編號(hào)為4的樣本擴(kuò)增出目的條帶，實(shí)驗(yàn)組2中6和8的樣本中擴(kuò)增出目的條帶，實(shí)驗(yàn)組3（中編號(hào)為9，10，11的樣本均擴(kuò)增出目的條帶，實(shí)驗(yàn)組4中編號(hào)為13，14的樣本擴(kuò)增出目的條帶。利用普通PCR對(duì)樣本進(jìn)行map基因擴(kuò)增，各組均沒有擴(kuò)增出目的基因；對(duì)目的基因FlaA進(jìn)行擴(kuò)增在實(shí)驗(yàn)組1中編號(hào)4的樣本中擴(kuò)增出目的基因，實(shí)驗(yàn)組2中編號(hào)為6和8的樣本擴(kuò)增出目的條帶,實(shí)驗(yàn)組4中編號(hào)為13的樣本擴(kuò)增出目的基因。 結(jié)論:1空腸彎曲菌有著多重調(diào)控和監(jiān)控基因，還有多重的毒力及耐藥性。GBS相關(guān)的空腸彎曲菌的毒力基因比NCTC11168要多，而且不同的致病菌株間也有很大差異，在致病過程中的粘附，入侵，細(xì)胞毒作用和支持作用的基因都各不相同，毒力較強(qiáng)的lulei株在所測(cè)的12中毒力基因中所含的毒力基因種類最多。耐藥性在致病菌株中同樣較NCTC11168種類多，這可能與醫(yī)源環(huán)境有關(guān)。有沒有可能是不同的菌株是通過不同的機(jī)制致病，目前還沒有足夠的證據(jù)證明，但是通過對(duì)毒力和耐藥基因的研究，的確存在基因的侵染及耐藥的不同性。 2實(shí)驗(yàn)中通過蒸煮法獲得的DNA用于空腸彎曲菌的身份鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明多重PCR并不適用于糞便中的空腸彎曲菌的鑒定，在濃度為10~6-10~3中其準(zhǔn)確率低于30%，多重PCR在鑒定細(xì)菌的過程中對(duì)循環(huán)體系的組成及溫度的要求是相對(duì)嚴(yán)格的。在此次實(shí)驗(yàn)分別選取三個(gè)基因16S，map和flaA基因利用普通PCR的方法對(duì)14個(gè)樣本進(jìn)行基因擴(kuò)增，其中16S為的測(cè)出率相對(duì)較高，陽(yáng)性率約為81.15%，而對(duì)于map基因的擴(kuò)增沒有得到陽(yáng)性的結(jié)果，在flaA基因中12個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本中擴(kuò)增出4個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性率約為33.33%。在三個(gè)普通PCR的結(jié)果中，16S的基因測(cè)出率相對(duì)較高，而其他的兩種基因結(jié)果不太理想，但是由于16S的特異性只局限在彎曲菌屬，不能對(duì)空腸彎曲菌進(jìn)行身份識(shí)別，所以對(duì)于彎曲菌中的目的基因的選取上還有很多值得研究的地方。
【關(guān)鍵詞】：吉蘭—巴雷綜合征 空腸彎曲菌 毒力基因 耐藥基因 快速鑒定 PCR
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.3;R3416
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文縮寫11-12
• 引言12-13
• 第一部分 空腸彎曲菌毒力及耐藥基因的分析13-33
• 前言13
• 材料與方法13-17
• 結(jié)果17-20
• 附圖20-24
• 附表24-27
• 討論27-29
• 小結(jié)29-30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 第二部分 糞便中空腸彎曲菌的快速分離33-44
• 前言33
• 材料與方法33-38
• 結(jié)果38-40
• 附圖40-42
• 討論42-43
• 小結(jié)43
• 參考文獻(xiàn)43-44
• 結(jié)論44-45
• 綜述 空腸彎曲菌質(zhì)粒及載體建立的研究及發(fā)展45-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 致謝53-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷54

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 孫國(guó)富,童克中;枯草桿菌(Bacillus subtilis)穩(wěn)定的基因表達(dá)系統(tǒng)[J];生物工程進(jìn)展;1991年01期

2 郭三堆,門大鵬,賈士芳;解淀粉芽孢桿菌賴氨酸-3基因在枯草芽孢桿菌中的克隆[J];遺傳學(xué)報(bào);1984年06期

3 喬明強(qiáng),蔡寶立,蔣如璋,高才昌,郎艷軍,樊廷玉,蘇同芳;芽孢桿菌基因工程新載體的構(gòu)建[J];遺傳學(xué)報(bào);1989年05期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 彭勇;豆豉溶栓酶的純化及其基因的克隆與表達(dá)研究[D];四川大學(xué);2002年

2 王海燕;脫毛蛋白酶產(chǎn)生菌的選育及其堿性蛋白酶基因的克隆與表達(dá)[D];四川大學(xué);2006年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張震;土傳植物病害拮抗細(xì)菌根圍生態(tài)學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2004年

本文編號(hào)：531707