發(fā)布時(shí)間：2017-07-04 19:16

  本文關(guān)鍵詞：攜帶CARex和PTDtat的重組5型腺病毒的獲得及其對(duì)日本血吸蟲童蟲感染效率的研究

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【摘要】：目的RNAi已經(jīng)成為生物體基因功能分析的非常重要的工具，雖然有文獻(xiàn)報(bào)道成功地將dsRNA通過浸泡或電穿孔方法導(dǎo)入血吸蟲各期達(dá)到基因沉默作用，然而這一技術(shù)在血吸蟲研究應(yīng)用中目前仍然存在一些問題，包括如何高效的將dsRNA、siRNA或shRNA表達(dá)載體高效地遞送到蟲體、降低遞送方法導(dǎo)致的死亡和達(dá)到長(zhǎng)期干擾效果，RNAi的長(zhǎng)期應(yīng)用就需要克服這些難關(guān)。本課題主要是研究Ad5能否感染日本血吸蟲童蟲，及其感染效率如何，并且對(duì)Ad5進(jìn)行了改建，插入可以提高Ad5感染效率的基因來增加Ad對(duì)日本血吸蟲的感染的可能性，作為Ad5應(yīng)用于日本血吸蟲童蟲RNAi的前期研究，為探索腺病毒載體介導(dǎo)的日本血吸蟲童蟲RNAi奠定初步的實(shí)踐基礎(chǔ)。。 方法通過體外連接方法成功構(gòu)建攜帶CARex、PTDtat和CARex-PTDtat融合基因的重組5型腺病毒質(zhì)粒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat質(zhì)粒；經(jīng)Pac I酶切線性化在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，在包裝細(xì)胞293A細(xì)胞中成功包裝出具有感染力的重組病毒顆粒；擴(kuò)增3代后，PCR鑒定目的基因的成功插入，然后用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID50）法測(cè)定病毒顆粒的滴度，滴度在108-109之間，為了得到高滴度的重組腺病毒，用氯化銫密度梯度離心法對(duì)重組腺病毒進(jìn)行純化，純化后的病毒滴度為1011。用3種重組腺病毒和野生型腺病毒分別感染CAR表達(dá)量不同的腫瘤細(xì)胞株，包括高表達(dá)的A549、中表達(dá)的HepG2和低表達(dá)的T24細(xì)胞，48h后倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)，然后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比及熒光強(qiáng)度。收集50只日本血吸蟲陽(yáng)性釘螺的尾蚴，通過機(jī)械法將尾蚴轉(zhuǎn)化為童蟲，然后進(jìn)行童蟲實(shí)驗(yàn)分別于48h后倒置熒光顯微鏡觀察觀察GFP在童蟲體內(nèi)的表達(dá)情況。 結(jié)果成功構(gòu)建和包裝重組5型腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示重組腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat組細(xì)胞GFP的表達(dá)量均高于野生型pAd，但是pAd-CARex-PTDtat作用效果要低于pAd-CARex和pAd-PTDtat組。流式細(xì)胞術(shù)顯示在A549、HepG2和T24細(xì)胞GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比是：野生型pAd組分別為54.8%、38.2%和8.52%；經(jīng)改建的重組pAd-CARex組分別為90.4%、79.2%和32.1%；重組pAd-PTDtat組分別為95.8%、98.8%和93.9%；重組pAd-CARex-PTDtat組分別為70.5%、53.4%和13.3%，在3種細(xì)胞中重組pAd-CARex與野生型pAd組相比較GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均提高33%，并且在3種細(xì)胞提高的百分比無明顯差別；重組pAd-PTDtat組平均提高61.6%，在T24細(xì)胞中提高近85%，在A549細(xì)胞提高了41%，在HepG2細(xì)胞提高了60%，具有明顯的作用效果，重組pAd-CARex-PTDtat平均提高僅僅約10%。4種重組病毒的平均熒光強(qiáng)度在A549細(xì)胞最強(qiáng)，HepG2次之，T24最弱。各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度中pAd-PTDtat組最強(qiáng)，pAd-CARex次之，pAd-CARex-PTDtat組最弱，，但是3組都高于野生型pAd。童蟲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：熒光顯微鏡檢查野生型pAd組、pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat均未見到GFP的表達(dá)，只有PTDtat組能看到微弱的GFP的表達(dá)。 結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CARex、PTDtat基因可以提高Ad5對(duì)CAR表達(dá)量的不同腫瘤細(xì)胞的感染效率，尤其是低表達(dá)CAR的腫瘤細(xì)胞，PTDtat基因的作用效果優(yōu)于CARex，但是將兩者聯(lián)合在一起作用效果反而較差；童蟲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野生型pAd和pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat不能感染日本血吸蟲童蟲，只有經(jīng)過改建后的重組腺病毒pAd-PTDtat對(duì)童蟲有微弱的感染，說明PTDtat基因的作用效果較好，可以提高Ad5對(duì)腫瘤細(xì)胞和日本血吸蟲童蟲的感染效率。
【關(guān)鍵詞】：腺病毒 CARex PTDtat 感染效率 日本血吸蟲童蟲
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R383.24
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-31
• 結(jié)果31-49
• 討論49-52
• 結(jié)論52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 附錄一 部分試劑配方56-60
• 附錄二 個(gè)人簡(jiǎn)歷60-61
• 附錄三 致謝61-62
• 附錄四 綜述62-70
• 參考文獻(xiàn)67-70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王穎;;中國(guó)血吸蟲病流行范圍及其與防治工作的關(guān)系[J];中國(guó)初級(jí)衛(wèi)生保健;2010年05期

本文編號(hào)：519038