本文關(guān)鍵詞：Caveolin-1在脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin重組中的作用及機(jī)制

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【摘要】：第一部分：篩選有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1表達(dá)的siRNA及其毒性檢測(cè) 目的篩選有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞小窩蛋白-1（caveolin-1）表達(dá)的小干擾RNA（small interference RNA, siRNA）序列，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性。 方法設(shè)計(jì)合成針對(duì)caveolin-1的siRNA3條（siRNA422,siRNA548,siRNA710）及一條帶綠色熒光標(biāo)記的通用陰性對(duì)照FAM-siRNA。在siRNAFect(siRNA transfectionreagent)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞。用Real-Time PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮細(xì)胞中caveolin-1mRNA的表達(dá)，Western blot方法測(cè)定干擾后caveolin-1蛋白表達(dá)，比較抑制率，篩選出有效抑制caveolin-1表達(dá)的siRNA。采用磺基羅丹明B法(sulforhodamineB，SRB)分析轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性。 結(jié)果①在siRNAFect相同劑量下，siRNA20、30或40nmol L~(-1)組轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到85%以上(P0.01)；②siRNAFect1.3μL復(fù)合10或20nmol L~(-1)siRNA組細(xì)胞存活率均達(dá)到80%以上（P0.05）；③siRNA548對(duì)EA.hy926細(xì)胞caveolin-1基因mRNA抑制效果最明顯(P0.01);④與陰性對(duì)照組及siRNA422、siRNA710相比，siRNA548干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞48h后,caveolin-1蛋白的表達(dá)量最低(P0.01)。 結(jié)論①siRNA548對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1表達(dá)的抑制效果最大。②siRNA濃度20nmol·L~(-1)復(fù)合siRNAFect1.3μL轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低，，適合轉(zhuǎn)染。 第二部分：Caveolin-1通過NF-κB途徑調(diào)控LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin的重組 目的探討小窩蛋白-1（caveolin-1）在脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白解聚中的作用及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926細(xì)胞株）為研究對(duì)象，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定貼壁融合后，根據(jù)不同的處理分為四組，每組6復(fù)孔：1）對(duì)照組（C組）；2）LPS10μg/ml組（L組）；3）LPS10ug/ml+cav-1-siRNA548預(yù)處理組（S組）；4) LPS10μg/ml+cav-1-siRNA548+L-NAME (N-硝基-L-精氨酸甲酯)10μM預(yù)處理組（N組）。根據(jù)LPS的作用時(shí)間，每組進(jìn)一步分為1、3、6和12小時(shí)組。使用Real-Time PCR測(cè)定各組peNOS-s1177和NF-κB的表達(dá)，同時(shí)采用直接免疫熒光染色法觀察各組F-actin的變化。 結(jié)果（1）與對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)L組和S組的peNOS-s1177表達(dá)均明顯增加（P0.01），其中S組peNOS-s1177表達(dá)更為顯著（P0.01）；與1h組比較，L組peNOS-s1177在6h時(shí)達(dá)到最大值（P0.01），12h時(shí)表達(dá)開始減少（P0.05）；而在S組，peNOS-s1177在3h達(dá)到最大值（P0.05），之后6h和12h表達(dá)逐漸減少（P0.01）；（2）與對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)L、S和N組的NF-κB表達(dá)均明顯增加（P0.01），其中L和N組的NF-κB在各時(shí)間點(diǎn)增加更為顯著（P0.01），而L組和N組之間表達(dá)無差異（P0.05）。在S組，NF-κB在3、6和12h表達(dá)顯著降低（P0.01）；(3)直接熒光染色發(fā)現(xiàn)在給予LPS6h后，EA.hy926細(xì)胞株F-actin出現(xiàn)明顯的解聚和重構(gòu)，其程度隨著時(shí)間的增加而加重。而采用cav-1-siRNA548預(yù)處理細(xì)胞株后，F(xiàn)-actin的解聚和重構(gòu)發(fā)生時(shí)間明顯推遲且程度較輕，并且L-NAME可以逆轉(zhuǎn)上述作用。 結(jié)論（1）caveolin-1參與了LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin解聚的調(diào)控；（2）caveolin-1可能通過eNOS-NF-κB途徑來調(diào)控F-actin的解聚和重構(gòu)。
【關(guān)鍵詞】：血管內(nèi)皮細(xì)胞 小窩蛋白-1（caveolin-1） 小干擾RNA NF-κB 脂多糖（Lipopolysaccharides LPS） 內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS） 纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 第一部分 篩選有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞 caveolin-1 表達(dá)的 siRNA 及其毒性檢測(cè)12-27
• 實(shí)驗(yàn)材料12-14
• 實(shí)驗(yàn)方法14-22
• 結(jié)果22-25
• 討論25-27
• 第二部分 Caveolin-1 通過 NF-κB 途徑調(diào)控 LPS 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞 F-actin 的解聚27-41
• 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 實(shí)驗(yàn)方法29-33
• 結(jié)果33-36
• 討論36-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 綜述45-55
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 中英文縮略詞表55-57
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文57-58
• 致謝58-59

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：518909