本文關(guān)鍵詞：漢坦病毒感染THP-1細(xì)胞激活炎癥小體通路及其分子機(jī)制的初步研究

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【摘要】：漢坦病毒（Hantavirus）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）、漢坦病毒屬（Hantaviruses），有20多個(gè)不同的型別。其中的漢灘病毒（Hantaan virus，，HTNV）、漢城病毒（Seoul virus，SEOV）、普馬拉病毒（Puumala virus，PUUV）等主要引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever withrenalsyndrome，HFRS），而辛諾柏病毒（SinNombre virus，SNV）等主要引起漢坦病毒肺綜合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）。我國(guó)流行的漢坦病毒主要是引起HFRS的HTNV和SEOV，尚未發(fā)現(xiàn)引起HPS的病毒；而且我國(guó)是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家，流行范圍廣，發(fā)病人數(shù)多，病死率較高，是我國(guó)危害最嚴(yán)重的急性傳染病之一。 目前HFRS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為除了病毒感染直接損傷外，免疫病理?yè)p傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增高和血漿滲漏是HFRS的主要病理基礎(chǔ)，其中大量炎癥因子的產(chǎn)生是其發(fā)生的主要分子基礎(chǔ)。已有多項(xiàng)研究顯示，HFRS患者外周血中多種細(xì)胞因子如VEGF、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-8、IP-10、RANTES等表達(dá)水平增多，這些因子與炎癥發(fā)生密切相關(guān)。其中主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β是一種典型的促炎分子，廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并可作為內(nèi)源性熱原質(zhì)引起機(jī)體發(fā)熱反應(yīng)，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。由于HFRS的三大主癥之一就是發(fā)熱，同時(shí)多項(xiàng)早期的研究表明，HFRS患者體內(nèi)IL-1β的水平在疾病進(jìn)程早期即有明顯的升高，因此IL-1β在HFRS疾病進(jìn)程中可能起到了一定的作用。 最新研究表明，炎癥小體通路活化是產(chǎn)生IL-1β等細(xì)胞因子的主要機(jī)制，而且多種病毒感染可激活炎癥小體通路。因此，本研究旨在明確漢坦病毒感染人外周血單核細(xì)胞THP-1后是否可產(chǎn)生IL-1β，并探討IL-1β的產(chǎn)生是否與炎癥小體通路的活化相關(guān)及其具體分子機(jī)制，從而為進(jìn)一步闡明IL-1β在漢坦病毒感染致病中的作用及其機(jī)制等提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【主要實(shí)驗(yàn)方法和研究結(jié)果】 1．HTNV可感染THP-1細(xì)胞并復(fù)制 利用乳鼠腦擴(kuò)增HTNV76-118株，制備病毒懸液，用微量細(xì)胞培養(yǎng)法測(cè)定病毒滴度為1.95×106PFU/ml。取MOI=10的HTNV分別感染THP-1、HUVEC和Vero E6細(xì)胞，24h后用FITC標(biāo)記的抗?jié)h坦病毒核衣殼蛋白的mAb進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示：在THP-1、HUVEC、Vero E6細(xì)胞的胞漿中均可見(jiàn)特異的綠色熒光顆粒，但是在THP-1細(xì)胞中的綠色熒光顆粒較HUVEC、Vero E6細(xì)胞中的為少。這提示HTNV可以感染THP-1細(xì)胞并增殖，但其復(fù)制水平低于在Vero E6細(xì)胞和HUVEC中的復(fù)制水平。 2．HTNV感染THP-1細(xì)胞后可誘導(dǎo)表達(dá)IL-1β 用MOI=1、MOI=2和MOI=10的HTNV76-118株分別感染THP-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)LPS、ATP刺激為陽(yáng)性對(duì)照，滅活病毒為陰性對(duì)照組，2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；24h后收集細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)其中的IL-1β。結(jié)果顯示，不同MOI的HTNV均可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，使用的病毒量越大，細(xì)胞分泌IL-1β的水平也越高。為觀察LPS預(yù)刺激是否影響HTNV感染THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的水平，先用0.05mg/ml的LPS對(duì)細(xì)胞預(yù)刺激2h，并設(shè)無(wú)LPS預(yù)刺激組；之后用MOI=0.1、MOI=2的HTNV分別進(jìn)行感染，2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；24h后收集細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)其中的IL-1β。結(jié)果顯示，LPS預(yù)刺激對(duì)HTNV感染THP-1細(xì)胞生成IL-1β的水平?jīng)]有明顯影響。為觀察病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β水平的變化，用MOI=1、MOI=10的HTNV感染THP-1細(xì)胞，2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別在6h、24h和48h收集細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)其中的IL-1β。結(jié)果顯示，感染的THP-1細(xì)胞生成的IL-1β水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中在24h時(shí)檢測(cè)到的IL-1β水平最高；MOI=10的病毒感染THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β的水平升高后下降趨勢(shì)比MOI=1時(shí)的下降趨勢(shì)減緩。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明HTNV感染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)了IL-1β。 用1mM的蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理THP-1細(xì)胞2h，用MOI=10的HTNV感染細(xì)胞，2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；24h后收集細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)其中的IL-1β。結(jié)果顯示，MG132處理細(xì)胞后，可明顯抑制HTNV感染THP-1生成IL-1β的水平，這提示HTNV感染細(xì)胞后IL-1β的產(chǎn)生不是病毒直接作用的結(jié)果，而是通過(guò)病毒活化某種分子通路所介導(dǎo)的。 3．HTNV感染THP-1細(xì)胞激活了炎癥小體通路相關(guān)分子 用MOI=10的HTNV76-118株和滅活的該毒株分別感染THP-1細(xì)胞，2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；在感染后6h、24h分別收集細(xì)胞，并提取細(xì)胞RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用qRT-PCR檢測(cè)炎癥小體通路中NLRP3、ASC、caspase-1及RIG-I的mRNA水平。結(jié)果顯示，與未感染組相比，HTNV活毒株和滅活毒株感染THP-1細(xì)胞中NLRP3、RIG-I分子的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，而接頭分子ASC的mRNA則在6h時(shí)開(kāi)始有顯著的升高，caspase-1的mRNA水平在24h時(shí)有顯著的升高。用MOI=10的HTNV感染THP-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)LPS及ATP作為陽(yáng)性對(duì)照處理THP-1細(xì)胞，2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；在感染后6h和24h后分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，用Western blot檢測(cè)pro-caspase-1、pro-IL-1β及caspase-1。結(jié)果顯示，HTNV感染THP-1細(xì)胞和LPS+ATP陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中pro-caspase-1及pro-IL-1β水解單體水平均明顯高于未感染組；HTNV感染THP-1細(xì)胞和LPS+ATP陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞上清中的caspase-1水平明顯高于未感染組。 4．HTNV感染THP-1細(xì)胞激活炎癥小體不依賴(lài)于K+外流 為檢測(cè)K+外流是否作為HTNV感染THP-1細(xì)胞激活炎癥小體的潛在機(jī)制，我們用3M KCl加入THP-1細(xì)胞中作用2h，再用MOI=10的HTNV76-118株感染細(xì)胞，2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；24h后收集細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)其中的IL-1β，結(jié)果顯示，當(dāng)胞外有或無(wú)高濃度的K+存在時(shí)，HTNV均可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，兩者水平相當(dāng)，表明HTNV刺激炎癥小體通路不依賴(lài)K+外流。 【結(jié)論】 漢坦病毒感染THP-1細(xì)胞后可產(chǎn)生IL-1β，炎癥小體通路的激活是其產(chǎn)生的分子機(jī)制，且該通路的激活不依賴(lài)K+外流，但漢坦病毒激活炎癥小體通路的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。本研究為深入理解IL-1β在HTNV感染致病過(guò)程中的作用及其具體機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：漢坦病毒 腎綜合征出血熱 人急性單核白血病細(xì)胞（THP-1） 炎癥小體 IL-1β
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R373.9
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-31
• 1 材料31-33
• 1.1 病毒、細(xì)胞、動(dòng)物31
• 1.2 主要儀器31-32
• 1.3 主要試劑32-33
• 1.4 常用液體的配制33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-40
• 2.1 HTNV 76-118 株的增殖及滴度測(cè)定33-34
• 2.2 THP-1 細(xì)胞分化為巨噬樣細(xì)胞的誘導(dǎo)34
• 2.3 HTNV 感染 THP-1 細(xì)胞及其免疫熒光法檢測(cè)34-35
• 2.4 ELISA 法檢測(cè) HTNV 感染 THP-1 細(xì)胞上清中的 IL-1β水平35-37
• 2.5 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè) HTNV感染 THP-1 細(xì)胞中炎癥小體相關(guān)分子的 mRNA37-38
• 2.6 Western Blot 檢測(cè) HTNV 感染 THP-1 細(xì)胞中 caspase-1 和 IL-1β38-40
• 2.7 HTNV 激活炎癥小體與 K+外流相關(guān)性的檢測(cè)40
• 3 結(jié)果40-48
• 3.1 HTNV 76-118 株的滴度測(cè)定結(jié)果40-41
• 3.2 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞分化為巨噬樣細(xì)胞的結(jié)果41
• 3.3 HTNV 感染 THP-1 細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果41-42
• 3.4 HTNV 感染 THP-1 細(xì)胞上清中 IL-1β的檢測(cè)結(jié)果42-45
• 3.5 HTNV 感染 THP-1 細(xì)胞中炎癥小體相關(guān)分子 mRNA 的檢測(cè)結(jié)果45-46
• 3.6 HTNV 感染 THP-1 細(xì)胞中炎癥小體相關(guān)分子的 Western blot 檢測(cè)結(jié)果46-48
• 3.7 HTNV 激活炎癥小體與 K+外流相關(guān)性的檢測(cè)結(jié)果48
• 4 討論48-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果62-63
• 致謝63-64

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：513687