本文關(guān)鍵詞：綠僵菌染色體核型分析及其侵染相關(guān)基因的FISH分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：真菌是一種真核生物，具有細胞壁和真正的細胞核，不含葉綠素，以寄生或者腐生的方式生存；典型真菌兼有有性生殖和無性生殖，并產(chǎn)生各種形態(tài)具有繁殖能力的孢子。真菌與人類的健康有著莫大的關(guān)系：青霉菌產(chǎn)生的青霉素可以治療細菌感染，與此同時，真菌也會對人類的健康帶來威脅，數(shù)據(jù)分析，對人類有致病性的真菌約有300多個種類，例如念珠菌引起的嬰兒念珠菌腸炎、毛癬菌引起的手足癬等都是由于真菌感染所引起；近年來，隨著高效廣譜抗生素、免疫抑制劑、抗惡性腫瘤藥物的廣泛應用，器官移植、導管技術(shù)以及外科其他介入性治療的深入開展，病原真菌引起的系統(tǒng)性真菌感染也日益增多，新出現(xiàn)的致病菌使病情也日趨嚴重，因此開發(fā)新的抗真菌藥物就成了當務(wù)之急。 綠僵菌是一種以昆蟲為宿主的絲狀真菌，由于其遺傳背景已經(jīng)研究清楚，并且對人、畜以及環(huán)境都無害，因此可以作為真菌侵染和致病機理研究的理想生物。如果對抗真菌藥物進行研究和開發(fā)，，就必須對真菌的侵染和致病機制進行研究；雖然目前已經(jīng)對真菌部分與侵染有關(guān)的基因進行了初步研究，如Pr1和Pr2蛋白酶基因，它們對真菌的侵染能力具有一定的調(diào)控作用，但是這些基因并不是單獨發(fā)揮作用，而是通過協(xié)同作用而達到完成侵染的過程，并產(chǎn)生生物學效應。明確侵染相關(guān)基因在染色體上的位置有助于了解、研究這些基因表達調(diào)控的模式及其在功能上的相關(guān)性，為從整體基因水平上研究真菌的侵染機制奠定基礎(chǔ)，也為將來研發(fā)阻斷真菌侵染的抗真菌藥物提供理論依據(jù)。 染色體核型分析是研究基因及功能基因組的基礎(chǔ)。只有在核型分析完成的基礎(chǔ)上才可以進行DNA標記和目的基因定位；目前對真菌的核型分析難度較大，由于真菌染色體較小，長度較短，著絲粒、隨體等特征標記都很難通過顯微鏡觀察到，已有的針對真菌核型研究的方法主要有有傳統(tǒng)光學顯微鏡觀察法以及脈沖凝膠電泳法（PFGE）兩種，由于真菌染色體較小，因此通過傳統(tǒng)光學顯微鏡對真菌進行觀察時都選用處于分裂中期的細胞，這樣才能在顯微鏡下分辨每條染色體，盡管如此也常常會低估真菌染色體的數(shù)目；脈沖凝膠電泳法由于其快速高效的檢測特點而被廣泛應用于不同物種染色體核型的分析，但它也有一定的局限性，比如無法直接觀察到染色體的形態(tài)，凝膠電泳只能分離10kb到10Mb大小的染色體，并且當多條染色體的大小很接近時通過脈沖凝膠電泳無法將其分離開來從而低估染色體的數(shù)目。采用光學顯微鏡法進行核型分析的真菌有Neurospora crassa，Tuber aestivum，Erysiphe graminis，Erysiphe，Penicillium chrysogeum等；采用脈沖凝膠電泳法進行核型分析的真菌有Nectria haematococca、Cochliobolus heterostrophus、Botrytos、Rhizoctonia solani等；因此對綠僵菌的核型研究和相關(guān)基因的定位將為該領(lǐng)域的研究提供新的研究方法和理論補充。 本研究以金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）菌株CQMa102為研究對象，通過構(gòu)建Pgpd-H1-GFP表達載體并在綠僵菌體內(nèi)表達從而可以對其有絲分裂行為進行活體動態(tài)觀察,并為核型分析提供一定的研究價值；使用改良的胚芽管爆裂制片法對綠僵菌進行染色體制片，通過傳統(tǒng)光學顯微鏡觀察染色體并進行核型分析，以及通過熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對核糖體RNA（rDNA）在綠僵菌染色體上的定位進行了分析，得出結(jié)論如下： 1Ma102綠僵菌有絲分裂行為的動態(tài)活體觀察 1.1Pgpd-H1-GFP表達載體的構(gòu)建并成功轉(zhuǎn)入綠僵菌 在帶有抗除草劑Bar（抗草銨膦）基因的PK2-PB-EGFP載體基礎(chǔ)上我們分別插入了組成型啟動子Pgpd片段和表達組蛋白H1片段，通過PCR、酶切和測序驗證確定重組Pgpd-H1-GFP載體成功構(gòu)建；再通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的方法使Pgpd-H1-GFP成功轉(zhuǎn)入綠僵菌體內(nèi)并穩(wěn)定表達。 1.2篩選綠僵菌H1-GFP表達菌株，對其有絲分裂行為進行活體動態(tài)觀察 通過熒光顯微鏡的觀察證實H1-GFP在綠僵菌體內(nèi)成功表達。H1-GFP定位于細胞核的染色體上，從而使染色體帶上可以識別的熒光標記。利用該轉(zhuǎn)化菌株可以對綠僵菌有絲分裂過程進行動態(tài)觀察；隨著顯微成像技術(shù)的提高，我們可以實現(xiàn)活體狀態(tài)下對綠僵菌染色體條數(shù)的統(tǒng)計和觀察，為綠僵菌染色體核型分析提供有力直接的依據(jù)。 2Ma102染色體核型分析 2.1Ma102染色體標本制備方法的改進 通過優(yōu)化酸處理時間及增加低滲等步驟，得出綠僵菌染色體核型標本制作方法如下：選取新鮮綠僵菌孢子使用1/4SDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10h，待孢子萌發(fā)長出胚芽后進行離心收集并使用甲醇和冰乙酸（V/V=17:3）進行固定過夜，再分別使用無水乙醇和70%乙醇進行固定，固定時間分別為2h；使用鹽酸解離法對綠僵菌細胞壁進行處理，處理條件為1M HCl60℃水浴處理8-14min；使用預冷的1×PBS低滲20min；烤片后使用吉姆薩或者DAPI進行染色，染色時間分別為30min和10min。 2.2顯微鏡觀察Ma102綠僵菌染色體并對其進行核型分析 顯微鏡下對綠僵菌染色體進行觀察，對60個清晰的核型標本進行了統(tǒng)計分析，得出Ma102綠僵菌染色體的平均數(shù)目為10條，Ma102綠僵菌染色體染色體平均相對長度分別為16.3%、13.4%、12.7%、11.3%、9.9%、8.9%、8.2%、7.2%、6.3%、5.7%。根據(jù)每條染色體的相對長度繪制其核型模式圖，通過觀察發(fā)現(xiàn)Ma102分裂前期染色體相對較長，并且在部分染色體照片中可以觀察到某條染色體的著絲點及隨體等結(jié)構(gòu)。 3綠僵菌rDNA的熒光原位雜交（FISH）分析 rDNA在綠僵菌染色體上進行熒光原位雜交 根據(jù)Roche公司試劑盒說明書和西南大學實驗室原位雜交流程，采用缺口平移法制備rDNA探針并與綠僵菌染色體標本進行雜交，通過一系列洗脫及信號檢測處理，最終通過熒光顯微鏡觀察到雜交信號，并拍照記錄和數(shù)據(jù)分析,為以后侵染相關(guān)基因的定位奠定理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：綠僵菌 染色體 核型分析 H1組蛋白 綠色熒光蛋白 rDNA 熒光原位雜交
【學位授予單位】：重慶理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R379
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 縮略詞13-14
• 1 緒論14-23
• 1.1 引言14
• 1.2 研究背景14-18
• 1.2.1 真菌染色體核型分析的研究14-17
• 1.2.2 有絲分裂行為動態(tài)觀察的研究17-18
• 1.2.3 熒光原位雜交技術(shù)的研究18
• 1.3 課題的立題依據(jù)與實驗目的18-19
• 1.3.1 立題依據(jù)18-19
• 1.3.2 實驗目的19
• 1.4 本課題研究內(nèi)容19-20
• 1.4.1 綠僵菌染色體的核型分析19-20
• 1.4.2 Pgpd-H1-GFP 表達載體的構(gòu)建20
• 1.4.3 Pgpd-H1-GFP/綠僵菌陽性轉(zhuǎn)化子的獲得20
• 1.4.4 Pgpd-H1-GFP/綠僵菌有絲分裂行為觀察20
• 1.4.5 熒光原位雜交20
• 1.5 技術(shù)路線20-21
• 1.5.1 綠僵菌 H1-GFP 融合表達菌株的構(gòu)建及其有絲分裂行為的動態(tài)觀察20-21
• 1.5.2 改進的染色體制片方法與綠僵菌核型分析21
• 1.5.3 綠僵菌 Ma102 的 rDNA 熒光原位雜交21
• 1.6 本課題創(chuàng)新之處21-23
• 2 綠僵菌 H1-GFP 融合表達菌株的建立及其有絲分裂行為的動態(tài)觀察23-37
• 2.1 實驗材料23-25
• 2.1.1 實驗所用菌株23
• 2.1.2 主要培養(yǎng)基及配制方法23
• 2.1.3 實驗所需主要試劑23-24
• 2.1.4 主要實驗試劑的配制24
• 2.1.5 主要設(shè)備24-25
• 2.2 實驗方法25-32
• 2.2.1 真菌基因組的大量提取25
• 2.2.2 Pgpd-H1-GFP 載體的構(gòu)建25-30
• 2.2.3 電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌30-31
• 2.2.4 農(nóng)桿菌介導的綠僵菌轉(zhuǎn)化實驗31
• 2.2.5 Pgpd-H1-GFP/綠僵菌陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定31-32
• 2.2.6 熒光顯微觀察 Pgpd-H1-GFP/綠僵菌的有絲分裂行為32
• 2.3 結(jié)果與分析32-36
• 2.3.1 Pgpd 和 H1 目的基因片段的克隆32-33
• 2.3.2 Pgpd-H1-GFP 質(zhì)粒的鑒定33
• 2.3.3 Pgpd-H1-GFP/綠僵菌陽性克隆的鑒定33-34
• 2.3.4 Pgpd-H1-GFP/綠僵菌陽性轉(zhuǎn)化子的顯微觀察34-35
• 2.3.5 H1-GFP 在綠僵菌有絲分裂中的行為觀察35-36
• 2.4 實驗討論36-37
• 3 綠僵菌染色體核型分析37-47
• 3.1 實驗材料37-38
• 3.1.1 實驗所用菌株37
• 3.1.2 主要培養(yǎng)基及配制方法37
• 3.1.3 實驗所需主要試劑37
• 3.1.4 主要實驗試劑的配制37
• 3.1.5 主要設(shè)備37-38
• 3.2 實驗方法38-39
• 3.2.1 菌絲的固定38
• 3.2.2 改良的胚芽管爆裂制片（GTBM）38-39
• 3.2.3 圖像采集與核型分析39
• 3.3 結(jié)果與分析39-45
• 3.3.1 載玻片上原生質(zhì)體的制備39-40
• 3.3.2 染色體的顯微觀察40-41
• 3.3.3 綠僵菌染色體條數(shù)統(tǒng)計41
• 3.3.4 核型分析41-44
• 3.3.5 核型模式圖44-45
• 3.4 實驗討論45-47
• 4 綠僵菌 rDNA 熒光原位雜交47-54
• 4.1 實驗材料47-48
• 4.1.1 實驗所用菌株47
• 4.1.2 主要培養(yǎng)基及配制方法47
• 4.1.3 實驗所需主要試劑47
• 4.1.4 主要實驗試劑的配制47-48
• 4.1.5 主要設(shè)備48
• 4.2 實驗方法48-51
• 4.2.1 rDNA 片段的獲取48-49
• 4.2.2 缺口平移法制作 rDNA 探針49
• 4.2.3 抗地高辛抗原結(jié)合片段的制備49
• 4.2.4 熒光原位雜交49-51
• 4.3 結(jié)果與分析51-53
• 4.3.1 rDNA PCR 擴增結(jié)果51-52
• 4.3.2 rDNA 探針的制備52
• 4.3.3 熒光原位雜交52-53
• 4.4 實驗討論53-54
• 5 主要結(jié)論54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻56-60
• 附錄 160-63
• 附錄 263

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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  本文關(guān)鍵詞：綠僵菌染色體核型分析及其侵染相關(guān)基因的FISH分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：504746