本文關(guān)鍵詞：共培養(yǎng)環(huán)境中兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)用于標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 目的：探討CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)標(biāo)記體外培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的可行性及其熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性。 方法：用無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)擴(kuò)增UMC-人iPS細(xì)胞系，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)辨別周邊少數(shù)自然分化的細(xì)胞，在嚴(yán)格無菌條件下人工挑取后用一次性輸液管移除，并用Western blot及免疫熒光檢測(cè)法對(duì)其干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定；選取配制5nmol/L、7.5nmol/L和10nmol/L三種不同濃度CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)對(duì)傳代擴(kuò)增的人iPS細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，，用活細(xì)胞三維去卷積成像系統(tǒng)觀察標(biāo)記效果；量子點(diǎn)標(biāo)記后的人iPS細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)、形態(tài)等情況，分別于1次傳代后1w和2次傳代后1w觀察熒光的穩(wěn)定性。 結(jié)果:倒置相差顯微鏡觀察到無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)擴(kuò)增的人iPS細(xì)胞以小克隆樣貼壁生長(zhǎng)，人工挑取結(jié)合一次性輸液管移除自然分化細(xì)胞，細(xì)胞克隆可持續(xù)維持未分化狀態(tài)生長(zhǎng)且逐漸融合成大克隆，Western blot及免疫熒光檢測(cè)均顯示iPS細(xì)胞中OCT4和Nanog兩種干細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)陽性；5nmol/L、7.5nmol/L和10nmol/L三種濃度的量子點(diǎn)應(yīng)用液均可標(biāo)記iPS細(xì)胞，濃度為10nmol/L量子點(diǎn)的標(biāo)記效果呈現(xiàn)出最明亮的橘紅色熒光；標(biāo)記后的iPS細(xì)胞傳代后在貼壁、生長(zhǎng)、擴(kuò)增和形態(tài)上無明顯變化，2次傳代后1w用活細(xì)胞三維去卷積成像系統(tǒng)仍可在細(xì)胞克隆中觀察到量子點(diǎn)熒光，與傳代前和1次傳代后1w相比熒光強(qiáng)度減弱。 結(jié)論: CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)可用于標(biāo)記示蹤人iPS細(xì)胞，在10nmol/L濃度內(nèi)熒光標(biāo)記呈濃度正相關(guān)依賴，本實(shí)驗(yàn)條件下量子點(diǎn)熒光至少可達(dá)2w，為iPS細(xì)胞在混合接觸共培養(yǎng)體系的誘導(dǎo)分化以及體內(nèi)細(xì)胞研究的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了優(yōu)化的標(biāo)記示蹤工具。 第二部分共培養(yǎng)環(huán)境中兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞分化 目的:觀察人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞混合接觸和插入式間接接觸共培養(yǎng)前后的形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)共培養(yǎng)前后人iPS細(xì)胞的部分標(biāo)志蛋白表達(dá)變化，初步探討iPS細(xì)胞向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的潛能。 方法:對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材的角膜組織內(nèi)皮細(xì)胞層進(jìn)行茜素紅染色，快速胰酶消化法分離兔原代CECs，培養(yǎng)至足夠數(shù)量后常規(guī)消化傳代。無飼養(yǎng)層細(xì)胞法培養(yǎng)擴(kuò)增UMC-人iPS細(xì)胞系，至生長(zhǎng)融合90%以上時(shí)消化，將1/2、1/3、1/4的iPS細(xì)胞懸液，加入到CECs中進(jìn)行混合接觸共培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞共存與相互影響情況并確定最佳細(xì)胞密度比例，1w后用原子力顯微鏡（AFM）觀測(cè)共培養(yǎng)前后人iPS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。量子點(diǎn)標(biāo)記人iPS細(xì)胞，以最佳密度比例建立人iPS細(xì)胞與兔CECs的混合接觸共培養(yǎng)體系，2w后用免疫熒光法檢測(cè)人iPS細(xì)胞分化前后的CD34、CD133、CD31和AQP1四種蛋白表達(dá)變化。另外，消化人iPS細(xì)胞以1:4、1:5、1:6傳代至Transwell小室中，插入生長(zhǎng)有60%融合狀態(tài)的第一代兔CECs的6孔板中，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞共存與相互影響情況并確定最佳細(xì)胞密度比例，插入式間接接觸共培養(yǎng)2w后免疫熒光法檢測(cè)人iPS細(xì)胞分化后上述四種蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:兔角膜組織的CECs茜素紅染色陽性呈六角形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間緊密排列；培養(yǎng)擴(kuò)增的兔CECs也具有六角形細(xì)胞形態(tài)，呈典型的鋪路石樣外觀�；旌辖佑|共培養(yǎng)體系最佳細(xì)胞密度比例為1/4iPS細(xì)胞懸液+60%兔CECs，即10nmol/L量子點(diǎn)標(biāo)記的人iPS細(xì)胞以1/4懸液與融合60%的兔CECs為最佳模型，兩種細(xì)胞能共同生存且相互影響；AFM（所選參數(shù)：細(xì)胞的二維和三維全貌、細(xì)胞直徑、核直徑以及近核處5um小區(qū)域細(xì)胞膜的均方根粗糙度和平均粗糙度）結(jié)合倒置顯微鏡觀察到混合接觸共培養(yǎng)后人iPS細(xì)胞體積增大，胞漿增多，核漿比減小，細(xì)胞膜表面凹陷結(jié)構(gòu)增多且加深加寬，突起結(jié)構(gòu)增多增高如指狀，膜表面均方根和平均粗糙度均增加，這些結(jié)果均向CECs靠近。1:5傳代的iPS細(xì)胞可以最佳狀態(tài)與60%兔CECs進(jìn)行間接共培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察人iPS細(xì)胞向多種形態(tài)細(xì)胞分化，無規(guī)律無方向。免疫熒光法檢測(cè)共培養(yǎng)前iPS細(xì)胞的CD34、CD133、CD31和AQP1表達(dá)均呈陰性，混合接觸共培養(yǎng)2w后人iPS細(xì)胞CD34、CD133、CD31表達(dá)陰性，AQP1表達(dá)呈陽性；間接接觸共培養(yǎng)2w后人iPS細(xì)胞上述4種蛋白表達(dá)均顯示陰性。 結(jié)論:共培養(yǎng)環(huán)境可誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上及部分標(biāo)志蛋白表達(dá)上向CECs方向分化，細(xì)胞密度比例、共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短、細(xì)胞因子的溝通交流、細(xì)胞的直接接觸等是誘導(dǎo)分化的重要因素。本研究為iPS細(xì)胞分化為CECs的研究奠定了基礎(chǔ)并提供了有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：量子點(diǎn) 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 標(biāo)記 示蹤 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 角膜內(nèi)皮細(xì)胞 共培養(yǎng) 原子力顯微鏡 分化
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-23
• 1 細(xì)胞共培養(yǎng)體系10-13
• 1.1 細(xì)胞共培養(yǎng)的應(yīng)用基礎(chǔ)10
• 1.2 細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立的方法10-12
• 1.3 細(xì)胞共培養(yǎng)在組織工程中的應(yīng)用12-13
• 2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞13-18
• 2.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)14
• 2.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的應(yīng)用14-18
• 3 量子點(diǎn)熒光探針18-21
• 3.1 量子點(diǎn)簡(jiǎn)介18-19
• 3.2 量子點(diǎn)熒光探針的應(yīng)用19-21
• 4 原子力顯微鏡技術(shù)21-22
• 4.1 原子力顯微鏡簡(jiǎn)介21
• 4.2 原子力顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用21-22
• 5 本實(shí)驗(yàn)研究的目的、內(nèi)容與意義22-23
• 第一部分 CdSe/ZnS 核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)用于標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞23-35
• 1 引言23
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法23-27
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑23-24
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 2.3 主要試劑的配制25-26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 3 結(jié)果27-28
• 4 討論28-31
• 5 附圖31-35
• 第二部分 共培養(yǎng)環(huán)境中兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)人 iPS 細(xì)胞分化35-53
• 1 引言35
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法35-41
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑35-36
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器36-37
• 2.3 主要試劑的配制37-38
• 2.4 實(shí)驗(yàn)分組38
• 2.5 細(xì)胞準(zhǔn)備38-39
• 2.6 人 iPS 細(xì)胞與兔 CECs 混合接觸共培養(yǎng)39
• 2.7 人 iPS 細(xì)胞的量子點(diǎn)標(biāo)記39-40
• 2.8 人 iPS 細(xì)胞與兔 CECs Transwell 間接共培養(yǎng)40
• 2.9 原子力顯微鏡觀察40
• 2.10 免疫熒光檢測(cè)40-41
• 3 結(jié)果41-44
• 3.1 茜素紅染色41
• 3.2 兔 CECs 的生長(zhǎng)情況41
• 3.3 倒置相差顯微鏡觀察41-43
• 3.4 原子力顯微鏡觀察43
• 3.5 免疫熒光檢測(cè)43-44
• 4 討論44-48
• 5 附圖48-53
• 參考文獻(xiàn)53-63
• 全文結(jié)論63-64
• 問題與展望64-65
• 主要英文縮略詞65-66
• 在校期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：共培養(yǎng)環(huán)境中兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：504663